Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

A transcrição, que produz moléculas de RNA usando DNA como modelo, é o primeiro passo da expressão gênica. A síntese de RNA bacteriano começa após a ligação da holoenzima RNA polimerase (RNAP) a um promotor-alvo^1,2. O holoenzyme de RNAP (RNAPholo) é compreendido de um núcleo catalítico do multi-subunit (RNAPcore) e de um fator σ, que seja exigido para reconhecer a seqüência do promotor. Ativadores de transcrição e repressores, coletivamente denominados TFs, regulam a expressão gênica através dos componentes de ligação do RNAPcore, σ fatores e/ou DNA. Dependendo do organismo, uma parcela significativa do seu genoma pode ser dedicada a TFs que regulam a transcrição em resposta às necessidades fisiológicas e sugestões ambientais³.

A clamídia é uma bactéria intracelular obrigatória responsável por uma variedade de doenças em humanos e animais^4,5,6,7,8. Por exemplo, Chlamydia trachomatis é indiscutivelmente o número um patógeno sexualmente transmitido em humanos em todo o mundo, e uma das principais causas de cegueira em alguns países subdesenvolvidos^4,5. A clamídia tem um ciclo de desenvolvimento único caracterizado por duas formas celulares alternadas denominadas de corpo elementar (EB) e corpo RETICULADO (RB)⁹. Considerando que, os EBs são capazes de sobreviver em um ambiente extracelular, eles são incapazes de proliferação. EBs entrar células hospedeiras através de endocitose e diferenciar em maior RBs em um vacuol no citoplasma hospedeiro dentro de horas após a inoculação. Não mais infeccioso, RBs proliferam através de fissão binária. Ao redor 20 h, começam diferenciar-se de volta ao EBs, que saem das pilhas do anfitrião ao redor 30-70 h.

A progressão do ciclo de desenvolvimento de clamídia é regulada pela transcrição. Visto que uma supermaioria dos quase 1.000 genes chlamydial é expressada durante o midcycle durante que RBs está replicando ativamente, somente um número pequeno de genes é transcrito imediatamente depois que a entrada de EBs nas pilhas do anfitrião para iniciar a conversão de EBs em RBs, e outro pequeno conjunto de genes são transcritos ou cada vez mais transcritos para permitir a diferenciação de RBs em EBs^10,11.

O genoma da clamídia codifica três fatores σ, ou seja, σ⁶⁶, σ²⁸ e σ⁵⁴. σ⁶⁶, que é equivalente ao housekeeping σ⁷⁰ de e . coli e outras bactérias, é responsável para reconhecer promotores de genes adiantados e meados de-ciclo assim como alguns genes atrasados, visto que σ²⁸ e σ⁵⁴ são exigidos para a transcrição de certos genes tardios. Vários genes são conhecidos por transportar um promotor σ⁶⁶-dependente e um promotor σ²⁸-dependente¹².

Apesar de um ciclo de desenvolvimento complicado, apenas um pequeno número de TFs foi encontrado em Chlamydiae¹³. Grga (anotado previamente como uma proteína hipotética CT504 em c. trachomatis sorovar D e em CTL0766 em c. trachomatis L2) é um TF Chlamydia-específico reconhecido inicialmente como um activador de σ⁶⁶-dependente genes¹⁴. Os ensaios de pulldown da afinidade demonstraram que GrgA ativa sua transcrição ligando σ⁶⁶ e ADN. Curiosamente, foi mais tarde encontrado com que GrgA também coprecipitates com σ²⁸, e ativa a transcrição de σ²⁸promotores dependentes in vitro¹⁵. Para investigar se GrgA tem afinidades similares ou diferentes para σ⁶⁶ e σ²⁸, nós recorramos a usar o bli. Os ensaios de BLI mostraram que o GrgA interage com σ⁶⁶ em uma afinidade 30-fold mais elevada do que com σ²⁸, sugerindo que Grga possa jogar papéis diferenciais em σ⁶⁶-dependente transcrição e σ²⁸-transcrição dependente ^{quinze anos}.

A BLI detecta o padrão de interferência da luz branca que reflete a partir de uma camada de proteína imobilizada na ponta de um biosensor e a compara à de uma camada de referência interna¹⁶. Através da análise destes dois padrões de interferência, a BLI pode fornecer informações valiosas e em tempo real sobre a quantidade de proteínas ligadas à ponta do biosensor. A proteína que é imobilizada à ponta do biosensor é referida como o ligand, e é imobilizada geralmente com a ajuda de um anticorpo comum ou de um Tag do epítopo (por exemplo, um poli-his-ou a biotina-etiqueta) que tem uma afinidade para uma partícula associada (tal como NTA ou Streptavidin) na ponta do biosensor. O emperramento de uma proteína secundária, referida como o analyte, com o ligante na ponta do biosensor cria mudanças na opacidade do biosensor e conseqüentemente conduz às mudanças em testes padrões da interferência. Quando repetida em diferentes concentrações do analito, a BLI pode fornecer não apenas informações qualitativas, mas também quantitativas, sobre a afinidade entre o ligantes e o analito¹⁶.

Ao melhor de nosso conhecimento, fomos os primeiros a empregar a BLI para caracterizar as interações proteína-proteína na transcrição¹⁵. Nesta publicação, demonstramos que um fragmento Grga, que foi anteriormente mostrado para ser exigido para σ²⁸-Binding, realmente Medeia a ligação. Este manuscrito centra-se nas etapas dos ensaios de BLI, e na geração de gráficos de BLI e em parâmetros da cinética obrigatória. Métodos para a produção (e purificação) de ligantes e analitos não são cobertos aqui.