転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用
Summary
RNAポリメラーゼとの転写因子(TF)の相互作用は、通常、プルダウンアッセイを用いて研究される。我々は、クラミジアRNAポリメラーゼとのGrgAの相互作用を特徴付けるためにバイオレイヤー干渉計(BLI)技術を適用する。プルダウンアッセイと比較して、BLIはリアルタイムの関連付けと解離を検出し、より高い感度を提供し、高い定量性を提供します。
Abstract
転写因子(TF)は、RNAポリメラーゼ、別のTF、および/またはテンプレートDNAと相互作用することによって遺伝子発現を調節するタンパク質です。GrgAは、クラミジアの義務的な細胞内細菌病原体に特異的に見出される新規転写活性化剤である。アフィニティビーズを用いたタンパク質プルダウンアッセイは、GrgAが2つのσ因子、すなわちσ66およびσ28に結合することを明らかにした。BLI を使用して、相互作用を確認し、さらに特徴付けしました。BLIはプルダウンに対していくつかの利点を示す:1)結合パートナー間のリアルタイムの関連付けと解離を明らかにし、2)定量的運動パラメータを生成し、3)プルダウンアッセイが検出に失敗するバインディングを検出することができる。これらの特性により、クラミジアにおける遺伝子発現調節におけるGrgAの生理的役割と、可能な詳細な相互作用機構を推測することが可能になりました。この比較的手頃な価格の技術は、転写やその他の生物学的プロセスの研究に非常に役立つことを想定しています。
Introduction
DNAをテンプレートとして用いてRNA分子を産生する転写は、遺伝子発現の第一歩です。細菌RNA合成は、標的プロモーター1、2へのRNAポリメラーゼ(RNAP)ホロエンザイムの結合に続いて開始する。RNAPホロエンザイム(RNAPholo)は、多単位触媒コア(RNAPcore)とσ因子で構成され、プロモーター配列の認識に必要です。転写活性化剤およびリプレッサは、総称してTFと呼び、RNAPcore、σ因子、および/またはDNAの結合成分を介して遺伝子発現を調節する。生物に応じて、そのゲノムのかなりの部分は、生理学的ニーズおよび環境手がかり3に応じて転写を調節するTFに専念してもよい。
クラミジアは、ヒトおよび動物の様々な疾患を担う義務的な細胞内細菌である4,5,6,7,8.例えば、クラミジア・トラコマティスは間違いなく世界中のヒトで性感染症の病原体の第1位であり、一部の未発達国における失明の主な原因である4、5。クラミジアは、素体(EB)とリチキュレート体(RB)9と呼ぶ2つの交互の細胞形態によって特徴付けられたユニークな発達サイクルを有する。一方、EBは細胞外環境で生存できるが、増殖はできない。EBはエンドサイトローシスを介して宿主細胞に入り、接種後数時間以内に宿主細胞質の真空中でより大きなRBに分化する。もはや感染性ではなく、RBはバイナリ核分裂を通じて増殖する。20時間頃、それらは30〜70時間の周りに宿主細胞を出るEBに戻って分化し始める。
クラミジア発達サイクルの進行は転写によって調節される。約1,000個のクラミジア遺伝子の超大部分が、RBが活発に複製している中間サイクル中に発現されるのに対し、宿主細胞へのEBの侵入直後に転写される遺伝子はごく少数のみであり、DB を RB に、および別の小さな遺伝子セットが書き起こされたり、BS10,11への分化を可能にするためにますます転写されたりする。
クラミジアゲノムは、σ66、σ28、σ 54の3つのσ因子をコードします。σ66は、大腸菌および他の細菌のハウスキーピングσ70に相当するが、初期および中期の遺伝子およびいくつかの後期遺伝子のプロモーターを認識する責任があるのに対し、σ28およびσ54は必要とされる。特定の後期遺伝子の転写。いくつかの遺伝子は、σ66依存性プロモーターとσ28依存性プロモーター12の両方を運ぶことが知られている。
複雑な発達サイクルにもかかわらず、クラミディア13では少数のTFしか見つかっていない。GrgA(C.トラコマティス血清DおよびCTL0766における架空タンパク質CT504として以前に注記されていたC.トラコマティスL2)は、最初にσ66-依存性遺伝子14の活性化剤として認識されたクラミジア特異的TFである。アフィニティプルダウンアッセイは、GrgAがσ66とDNAの両方を結合することによって転写を活性化することを実証しました。興味深いことに、GrgAもσ28と共沈殿し、σ28依存性プロモーターからの転写をインビトロ15で活性化していることが後に判明した。GrgAがσ66とσ28に類似しているか異なる親和性を有するかを調べるために、BLIを使用することにしました。BLIアッセイは、GrgAがσ28よりも30倍高い親和性でσ66と相互作用することを示しており、GrgAがσ66-従属転写およびσ28依存転写において差動の役割を果たす可能性があることを示唆している。15.
BLIは、バイオセンサの先端にある固定化タンパク質の層から反射する白色光の干渉パターンを検出し、内部基準層16の干渉パターンと比較する。これらの2つの干渉パターンの分析を通じて、BLIはバイオセンサの先端に結合したタンパク質の量に関する貴重でリアルタイムの情報を提供することができます。バイオセンサの先端に固定化されたタンパク質はリガンドと呼ばれ、一般に、関連する粒子(NTAまたはビオチンタグなど)に対する親和性を有する一般的な抗体またはエピトープタグ(例えば、ポリヒスタグまたはビオチンタグ)の助けを借りて固定化される。バイオセンサの先端にストレプトアビジン)。バイオセンサの先端にあるリガンドとの二次タンパク質の結合は、バイオセンサの不透明度の変化を引き起こし、したがって干渉パターンの変化をもたらす。異なる濃度のアナリテを繰り返すと、BLIは、定性的なだけでなく、リガンドとアナリテ16との親和性に関する定量的情報も提供できる。
私たちの知るなかでは、転写15でタンパク質とタンパク質の相互作用を特徴付けるためにBLIを採用した最初の人でした。本書では、σ28-バインディングに必要であることが以前に示されていたGrgAフラグメントが実際に結合を仲介することを示す。この原稿は、BLIアッセイのステップ、およびBLIグラフの生成と結合動態のパラメータに焦点を当てています。リガンドおよび解剤の製造(および精製)の方法については、ここでは説明しません。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質とタンパク質の相互作用は、転写および他の生物学的プロセスの調節にとって重要である。彼らは最も一般的にプルダウンアッセイを通じて研究されています。プルダウンアッセイは比較的簡単に実行できますが、定量的に低く、弱いが生物学的に有意義な相互作用を検出できない場合があります。対照的に、リガンドとアナリテの間のリアルタイムの関連付けと解離を検出する?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(助成金#AI122034とAI140167)とニュージャージー州保健財団(助成金#PC 20-18)によってサポートされました。
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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