Uso da microscopia de força atômica para medir propriedades mecânicas e pressão de turgor de células vegetais e tecidos vegetais
Summary
Aqui, nós apresentamos a microscopia de força atômica (AFM), operada como uma ferramenta do nano-e do micro-Indentation em pilhas e em tecidos. O instrumento permite a aquisição simultânea de topografia de superfície 3D da amostra e suas propriedades mecânicas, incluindo a parede celular módulo de Young, bem como a pressão de turgor.
Abstract
Apresentamos aqui o uso da microscopia de força atômica para recuar os tecidos vegetais e recuperar suas propriedades mecânicas. Usando dois microscópios diferentes no modo de recuo, mostramos como medir um módulo elástico e usá-lo para avaliar as propriedades mecânicas da parede celular. Além disso, também explicamos como avaliar a pressão de turgor. As principais vantagens da microscopia de força atômica são que ele é não-invasivo, relativamente rápido (5 ~ 20 min), e que virtualmente qualquer tipo de tecido vegetal que é superficialmente plana pode ser analisado sem a necessidade de tratamento. A resolução pode ser muito boa, dependendo do tamanho da ponta e do número de medições por unidade de área. Uma limitação deste método é que dá somente o acesso direto à camada superficial da pilha.
Introduction
A microscopia da força atômica (AFM) pertence à família da microscopia da sonda da exploração (SPM), onde uma ponta com um raio de geralmente alguns nanômetros examina a superfície de uma amostra. A detecção de uma superfície não é alcançada através de métodos ópticos ou baseados em elétrons, mas através das forças de interação entre a ponta e a superfície da amostra. Assim, esta técnica não se limita à caracterização topográfica de uma superfície amostral (resolução 3D que pode descer para poucos nanômetros), mas também permite a medição de qualquer tipo de força de interação, como eletrostática, Van der Waals ou forças de contato. Além disso, a ponta pode ser usada para aplicar forças na superfície de uma amostra biológica e medir a deformação resultante, o chamado “recuo”, a fim de determinar suas propriedades mecânicas (por exemplo, módulo de Young, propriedades viscoelásticas).
As propriedades mecânicas das paredes das células vegetais são essenciais para serem levadas em conta ao tentarem compreender os mecanismos subjacentes aos processos de desenvolvimento1,2,3. Certamente, estas propriedades são controladas firmemente durante o desenvolvimento, no detalhe desde que o amolecimento da parede celular é exigido para permitir que as pilhas cresçam. AFM pode ser usado para medir essas propriedades e estudar a maneira como eles mudam entre órgãos, tecidos ou estágios de desenvolvimento.
Neste artigo, nós descrevemos como nós usamos AFM para medir propriedades mecânicas da parede de pilha e a pressão do turgor. Estas duas aplicações são demonstradas em dois microscópios diferentes de AFM e são detalhadas aqui em seguida.
Protocol
Representative Results
Discussion
O surgimento de formas em plantas é determinado principalmente pela taxa coordenada e direção do crescimento durante o tempo e o espaço. Células vegetais são envoltos em uma parede celular rígida feita de uma matriz polissacarídico, que cola-los juntos. Em conseqüência, a expansão da pilha é controlada pelo equilíbrio entre a pressão do turgor que puxa na parede de pilha, e a rigidez da parede de pilha que resiste a esta pressão. A fim compreender os mecanismos que são subjacentes ao desenvolvimento, é i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a equipe PLATIM por seu apoio técnico, bem como Arezki Boudaoud e membros da equipe biofísica no laboratório RDP para discussões úteis.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
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