Использование атомной микроскопии силы для измерения механических свойств и тургорского давления растительных клеток и тканей растений
Summary
Здесь мы представляем атомную силовую микроскопию (AFM), функционируют как нано- и микро-индентационный инструмент на клетках и тканях. Прибор позволяет одновременно приобрести 3D-топографию образца и его механические свойства, включая модуль клеточной стенки Янга, а также тургорное давление.
Abstract
Мы представляем здесь использование атомной микроскопии силы для интовенции ткани растений и восстановить его механические свойства. Используя два различных микроскопа в режиме отступа, мы показываем, как измерить упругий модуль и использовать его для оценки механических свойств клеточной стенки. Кроме того, мы также объясняем, как оценить давление тургора. Основные преимущества атомной микроскопии силы в том, что она является неинвазивной, относительно быстрой (5–20 минут) и что практически любой тип живой ткани растений, который поверхностно плоский, может быть проанализирован без необходимости лечения. Разрешение может быть очень хорошим, в зависимости от размера наконечника и от количества измерений на единицу площади. Одним из ограничений этого метода является то, что он дает только прямой доступ к поверхностным слоям клеток.
Introduction
Атомная микроскопия силы (AFM) принадлежит к семейстств микроскопии зонда (SPM), где наконечник с радиусом обычно немного nanometers сканирует поверхность образца. Обнаружение поверхности достигается не оптическими или электронными методами, а силами взаимодействия между кончиком и поверхностью образца. Таким образом, этот метод не ограничивается топографической характеристикой поверхности образца (3D-разрешение, которое может сойти на несколько нанометров), но также позволяет измерять любые типы взаимодействуютных сил, таких как электростатические, ван дер Ваалс или контактные силы. Кроме того, наконечник может быть использован для применения сил на поверхности биологического образца и измерения результирующей деформации, так называемой “отступной”, для определения его механических свойств (например, модуля Янга, вискоэлясические свойства).
Механические свойства стенок растительных клеток необходимы для учета при попытке понять механизмы, лежащие в основе процессов развития1,2,3. Действительно, эти свойства жестко контролируются во время развития, в частности, так как размягчение клеточной стенки требуется, чтобы позволить клеткам расти. AFM может быть использован для измерения этих свойств и изучения того, как они меняются между органами, тканями или стадиями развития.
В этой статье мы описываем, как мы используем AFM для измерения как механических свойств стенки клеток, так и давления тургора. Эти два приложения демонстрируются на двух различных микроскопах AFM и подробно описаны здесь после.
Protocol
Representative Results
Discussion
Появление форм в растениях в основном определяется скоординированной скоростью и направлением роста во времени и пространстве. Растительные клетки заключены в жесткую клеточную стенку из полисахаридной матрицы, которая склеивает их вместе. В результате, расширение клетки контролиру…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить команду PLATIM за техническую поддержку, а также Арески Будауда и членов команды по биофизике в лаборатории RDP за полезные обсуждения.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
