שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים
Summary
כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.
Abstract
אנו מציגים כאן את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי לכניסה רקמות הצמח ולשחזר את תכונותיו המכאניות. באמצעות שני מיקרוסקופים שונים במצב כניסה, אנו מראים כיצד למדוד מודול אלסטי ולהשתמש בו כדי להעריך תכונות מכניות של קיר התא. בנוסף, אנו גם מסבירים כיצד להעריך לחץ טורגור. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופ הכוח האטומי הם שהוא לא פולשני, מהיר יחסית (5 ~ 20 דקות), וכי כמעט כל סוג של רקמת צמחים חיים שטוח באופן שטחי ניתן לנתח ללא צורך בטיפול. הרזולוציה יכולה להיות טובה מאוד, בהתאם לגודל הקצה ולמספר המידות לכל אזור יחידה. מגבלה אחת של שיטה זו היא שהיא מעניקה רק גישה ישירה לשכבת התא השטחית.
Introduction
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שייך מיקרוסקופ בדיקה סריקה (SPM) משפחה, שם טיפ עם רדיוס של בדרך כלל ננומטרים כמה סורקת את פני השטח של מדגם. גילוי משטח אינו מושג בשיטות אופטיות או באמצעות אלקטרון, אלא דרך כוחות האינטראקציה בין הקצה לבין משטח המדגם. לפיכך, טכניקה זו אינה מוגבלת לאפיון טופוגרפי של משטח לדוגמה (רזולוציה תלת-ממדית שיכולה לרדת לכמה ננומטר), אלא גם מאפשרת את המדידה של כל סוג של כוחות אינטרקציה כגון אלקטרוסטטית, ואן דר וואלס או כוחות מגע. יתר על כן, ניתן להשתמש בעצה כדי להחיל כוחות על פני השטח של דגימה ביולוגית ולמדוד את דפורמציה כתוצאה מכך, את מה שמכונה “כניסות”, כדי לקבוע את תכונותיו המכאניות (למשל, מודולוס של יאנג, מאפיינים אלסטיים).
תכונות מכניות של קירות תא הצמח חיוניים להילקח בחשבון כאשר מנסים להבין מנגנונים בבסיס תהליכים התפתחותיים1,2,3. ואכן, מאפיינים אלה נשלטים באופן הדוק במהלך הפיתוח, במיוחד מאחר שריכוך הקירות התאי נדרש כדי לאפשר לתאים לצמוח. AFM יכול לשמש כדי למדוד מאפיינים אלה וללמוד את האופן שבו הם משתנים בין איברים, רקמות או שלבים התפתחותיים.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים AFM למדוד את שני הקירות התא תכונות מכניות ולחץ טורגור. שני יישומים אלה מומחש בשני מיקרוסקופים AFM שונים ומפורטים כאן לאחר מכן.
Protocol
Representative Results
Discussion
הופעתה של צורות בצמחים נקבעת בעיקר על ידי הקצב המתואם וכיוון הצמיחה בזמן ובמרחב. תאי הצמחים מארוזים בקיר תא קשיח העשוי ממטריצה פוליסכדידיום, אשר מדביק אותם יחד. כתוצאה מכך, הרחבת התא נשלטת על ידי שיווי משקל בין לחץ טורגור מושך את קיר התא, ואת הנוקשות של קיר התא התנגדות ללחץ זה. כדי להבין את ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להודות לצוות הפלטים על התמיכה הטכנית שלהם, כמו גם ארצקי בודאוד וחברי צוות הביוסיק במעבדת RDP לדיונים מועילים.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
