Summary

Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben

Published: July 15, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.

Abstract

Wir stellen hier den Einsatz der Atomkraftmikroskopie vor, um Pflanzengewebe einzurücken und seine mechanischen Eigenschaften wiederzuerlangen. Anhand von zwei verschiedenen Mikroskopen im Einzugsmodus zeigen wir, wie man einen elastischen Modul misst und damit mechanische Eigenschaften der Zellwand bewertet. Darüber hinaus erklären wir auch, wie der Turgordruck bewertet wird. Die Hauptvorteile der Atomkraftmikroskopie sind, dass sie nicht-invasiv, relativ schnell (5 bis 20 min) ist und dass praktisch jede Art von lebendem Pflanzengewebe, das oberflächlich flach ist, ohne Behandlungsbedarf analysiert werden kann. Die Auflösung kann sehr gut sein, abhängig von der Spitzengröße und der Anzahl der Messungen pro Flächeneinheit. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nur direkten Zugriff auf die oberflächliche Zellschicht gewährt.

Introduction

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) gehört zur Scan-Sondenmikroskopie-Familie (SPM), bei der eine Spitze mit einem Radius von in der Regel wenigen Nanometern die Oberfläche einer Probe scannt. Die Detektion einer Oberfläche erfolgt nicht über optische oder elektronenbasierte Methoden, sondern über die Wechselwirkungskräfte zwischen der Spitze und der Probenoberfläche. Somit beschränkt sich diese Technik nicht auf die topographische Charakterisierung einer Probenoberfläche (3D-Auflösung, die auf wenige Nanometer sinken kann), sondern ermöglicht auch die Messung jeder Art von Wechselwirkungskräften wie Elektrostatik, Van der Waals oder Kontaktkräften. Darüber hinaus kann die Spitze verwendet werden, um Kräfte an der Oberfläche einer biologischen Probe anzuwenden und die resultierende Verformung, die sogenannte “Einrückung”, zu messen, um ihre mechanischen Eigenschaften (z.B. Young-Modul, viskoelastische Eigenschaften) zu bestimmen.

Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellwänden sind wichtig, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die Entwicklungsprozessen zugrunde liegen,1,2,3zu berücksichtigen. Tatsächlich werden diese Eigenschaften während der Entwicklung streng kontrolliert, insbesondere da eine Zellwandenthärtung erforderlich ist, damit Zellen wachsen können. AFM kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und zu untersuchen, wie sie zwischen Organen, Geweben oder Entwicklungsstadien wechseln.

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir AFM verwenden, um sowohl die mechanischen Eigenschaften der Zellwand als auch den Turgordruck zu messen. Diese beiden Anwendungen werden auf zwei verschiedenen AFM-Mikroskopen demonstriert und werden hier danach detailliert beschrieben.

Protocol

1.Messung der mechanischen Eigenschaften der Zellenwand HINWEIS: Beispiel für das sich entwickelnde Gynoezium von Arabidopsis wird vorgestellt. Vorbereitung der biologischen Proben Sammeln Sie eine geschlossene Blütenknospe in Stufe 9 bis 10 (ca. 0,5 mm lang) nach veröffentlichten Stufen Bestimmung für Arabidopsis4. Unter einem Fernglas, mit feiner Pinzette, vorsichtig öffnen Sie die Knospe, um den Entw…

Representative Results

Abbildung 1A und Abbildung 1B zeigen einen Screenshot, der das Ergebnis der Schritte 1.3.4 bis 1.3.6 des Protokolls veranschaulicht, der verwendet wird, um eine Interessenregion zu finden, in der die QI-Karte erworben werden soll. Es ist erwähnenswert, dass die Region von Interesse gewählt wurde, um nicht auf einer geneigten Oberfläche (d.h. so flach wie möglich) zu sein. Tatsächlich, wie routier et al.5</s…

Discussion

Die Entstehung von Formen in Pflanzen wird hauptsächlich durch die koordinierte Geschwindigkeit und Wachstumsrichtung in Zeit und Raum bestimmt. Pflanzenzellen sind in einer starren Zellwand aus einer polysaccharidischen Matrix eingeschlossen, die sie zusammenklebt. Dadurch wird die Zellausdehnung durch das Gleichgewicht zwischen dem Turgordruck, der an der Zellwand zieht, und der Steifigkeit der Zellwand gesteuert, die diesem Druck standhält. Um die Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, ist es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem PLATIM-Team für die technische Unterstützung sowie Arezki Boudaoud und Mitgliedern des Biophysic-Teams im RDP-Labor für hilfreiche Diskussionen.

Materials

Growth medium
1000x vimatin stock solution used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) Sigma-Aldrich/Merck 132-66-1 add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
agar-agar Sigma-Aldrich/Merck 9002-18-0 add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
agarose Merck Millipore 9012-36-6 used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium Duchefa Biochimie DU0742.0025 For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich/Merck 13477-34-4 add to Arabidopsis medium, 2mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM Duchefa Biochimie M0221.0025 Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.
N6-benzyladenine (BAP) Sigma-Aldrich/Merck 1214-39-7 used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
oryzalin Sigma-Aldrich/Merck 19044-88-3 for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
plant preservation mixture (PPM) Plant Cell Technology used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide Duchefa Biochimie 1310-58-3 used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
sucrose Duchefa Biochimie 57-50-1 used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM Bruker The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion JPK (Bruker) The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix UHU D1620
Reference elasitic structure NanoIdea 2Z00026
Reprorubber-Thin Pour Flexbar 16135 biocompatible glue.
Spherical AFM tips Nanoandmore SD-SPHERE-NCH-S-10 Tips used for measuring mechanical properties.

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Cite This Article
Bovio, S., Long, Y., Monéger, F. Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues. J. Vis. Exp. (149), e59674, doi:10.3791/59674 (2019).

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