Summary

Uso de la Microscopía de Fuerza Atómica para Medir las Propiedades Mecánicas y la Presión Turgor de Células Vegetales y Tejidos Vegetales

Published: July 15, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.

Abstract

Aquí presentamos el uso de la microscopía de fuerza atómica para destetar los tejidos vegetales y recuperar sus propiedades mecánicas. Usando dos microscopios diferentes en modo de sangría, mostramos cómo medir un módulo elástico y usarlo para evaluar las propiedades mecánicas de la pared celular. Además, también explicamos cómo evaluar la presión del turgor. Las principales ventajas de la microscopía de fuerza atómica son que no es invasiva, relativamente rápida (5-20 min), y que prácticamente cualquier tipo de tejido vegetal vivo que es superficialmente plano se puede analizar sin necesidad de tratamiento. La resolución puede ser muy buena, dependiendo del tamaño de la punta y del número de medidas por unidad de área. Una limitación de este método es que sólo da acceso directo a la capa de celda superficial.

Introduction

La microscopía de fuerza atómica (AFM) pertenece a la familia de microscopía de sonda de exploración (SPM), donde una punta con un radio de unos pocos nanómetros escanea la superficie de una muestra. La detección de una superficie no se logra a través de métodos ópticos o basados en electrones, sino a través de las fuerzas de interacción entre la punta y la superficie de la muestra. Por lo tanto, esta técnica no se limita a la caracterización topográfica de una superficie de muestra (resolución 3D que puede bajar a unos pocos nanómetros), sino que también permite la medición de cualquier tipo de fuerzas de interacción como electrostática, van der Waals o fuerzas de contacto. Además, la punta se puede utilizar para aplicar fuerzas en la superficie de una muestra biológica y medir la deformación resultante, la llamada “indentación”, con el fin de determinar sus propiedades mecánicas (por ejemplo, módulo de Young, propiedades viscoelásticas).

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares de la planta son esenciales a tener en cuenta a la hora de tratar de comprender los mecanismos subyacentes a los procesos de desarrollo1,2,3. De hecho, estas propiedades se controlan estrechamente durante el desarrollo, en particular porque se requiere un ablandamiento de la pared celular para permitir que las células crezcan. AFM se puede utilizar para medir estas propiedades y estudiar la forma en que cambian entre órganos, tejidos o etapas del desarrollo.

En este artículo, describimos cómo usamos AFM para medir las propiedades mecánicas de la pared celular y la presión del turgencia. Estas dos aplicaciones se demuestran en dos microscopios AFM diferentes y se detallan aquí después.

Protocol

1.Medida de las propiedades mecánicas de la pared celular NOTA: Ejemplo del desarrollo de gineceo de Arabidopsis se presenta. Preparación de las muestras biológicas Recoger un brote de flores cerrado en la etapa 9 a 10 (aproximadamente 0,5 mm de largo) según la determinación de etapas publicadas para Arabidopsis4. Bajo un binocular, utilizando pinzas finas, abrir cuidadosamente el cogollo para comprobar…

Representative Results

La Figura 1A y la Figura 1B muestran una captura de pantalla que ilustra el resultado de los pasos 1.3.4 a 1.3.6 del protocolo, utilizado para localizar una región de interés donde adquirir el mapa QI. Vale la pena mencionar que la región de interés ha sido elegida para no estar sobre una superficie inclinada (es decir, lo más plana posible). En realidad, como se notó en Routier et al.5, si el eje de…

Discussion

La aparición de formas en las plantas está determinada principalmente por la tasa coordinada y la dirección del crecimiento durante el tiempo y el espacio. Las células vegetales están encerradas en una pared rígida de células hecha de una matriz polisacárdica, que las pega. Como resultado, la expansión celular se controla mediante el equilibrio entre la presión del turgencia tirando de la pared celular, y la rigidez de la pared celular resistiéndose a esta presión. Con el fin de entender los mecanismos subyac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al equipo de PLATIM por su apoyo técnico, así como a Arezki Boudaoud y a los miembros del equipo de Biophysic en el laboratorio rdp por sus útiles debates.

Materials

Growth medium
1000x vimatin stock solution used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) Sigma-Aldrich/Merck 132-66-1 add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
agar-agar Sigma-Aldrich/Merck 9002-18-0 add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
agarose Merck Millipore 9012-36-6 used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium Duchefa Biochimie DU0742.0025 For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich/Merck 13477-34-4 add to Arabidopsis medium, 2mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM Duchefa Biochimie M0221.0025 Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.
N6-benzyladenine (BAP) Sigma-Aldrich/Merck 1214-39-7 used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
oryzalin Sigma-Aldrich/Merck 19044-88-3 for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
plant preservation mixture (PPM) Plant Cell Technology used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide Duchefa Biochimie 1310-58-3 used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
sucrose Duchefa Biochimie 57-50-1 used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM Bruker The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion JPK (Bruker) The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix UHU D1620
Reference elasitic structure NanoIdea 2Z00026
Reprorubber-Thin Pour Flexbar 16135 biocompatible glue.
Spherical AFM tips Nanoandmore SD-SPHERE-NCH-S-10 Tips used for measuring mechanical properties.

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Cite This Article
Bovio, S., Long, Y., Monéger, F. Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues. J. Vis. Exp. (149), e59674, doi:10.3791/59674 (2019).

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