Gebruik van atoom kracht microscopie om mechanische eigenschappen en turgor druk van plantencellen en Plantenweefsels te meten
Summary
Hier presenteren we atomaire kracht microscopie (AFM), die wordt gebruikt als een nano-en micro-indentatie tool op cellen en weefsels. Het instrument maakt gelijktijdige verwerving van 3D-oppervlaktetopografie van het monster en de mechanische eigenschappen mogelijk, met inbegrip van de modulus van de celwand Young en de turgor-druk.
Abstract
We presenteren hier het gebruik van atoom kracht microscopie om plantenweefsels te laten inspringen en de mechanische eigenschappen ervan te herstellen. Met behulp van twee verschillende microscopen in de indentatie modus laten we zien hoe u een elastische modulus meet en gebruikt om de mechanische eigenschappen van de celwand te evalueren. Daarnaast leggen we ook uit hoe turgor druk moet worden geëvalueerd. De belangrijkste voordelen van atoom kracht microscopie zijn dat het niet-invasieve, relatief snelle (5 ~ 20 min), en dat vrijwel elk type levend plantenweefsel dat oppervlakkig plat is kan worden geanalyseerd zonder de noodzaak voor behandeling. De resolutie kan zeer goed zijn, afhankelijk van de tip grootte en het aantal metingen per eenheid gebied. Een beperking van deze methode is dat het alleen directe toegang tot de oppervlakkige cellaag geeft.
Introduction
Atomaire kracht microscopie (AFM) behoort tot de Scanning probe microscopie (SPM) familie, waarbij een tip met een straal van meestal een paar nanometers het oppervlak van een monster scant. De detectie van een oppervlak wordt niet bereikt via optische of elektron-gebaseerde methoden, maar via de interactie krachten tussen de punt en het monster oppervlak. Deze techniek is dus niet beperkt tot topografische karakterisering van een monster oppervlak (3D-resolutie die naar een paar nanometers kan gaan), maar maakt het ook mogelijk om elk type interactie krachten zoals elektrostatische, van der Waals of contactkrachten te meten. Bovendien kan de tip worden gebruikt om krachten aan het oppervlak van een biologisch monster toe te passen en de resulterende vervorming, de zogenaamde “Inkeping”, te meten om de mechanische eigenschappen ervan te bepalen (bv., jonge modulus, visco-elastische eigenschappen).
Mechanische eigenschappen van planten celwanden zijn essentieel om in aanmerking te worden genomen bij het proberen te begrijpen van mechanismen die onderliggende ontwikkelingsprocessen1,2,3. Inderdaad, deze eigenschappen worden strak gecontroleerd tijdens de ontwikkeling, in het bijzonder omdat de celwand verzachting nodig is om cellen te laten groeien. De AFM kan worden gebruikt om deze eigenschappen te meten en de manier te bestuderen waarop ze veranderen tussen organen, weefsels of ontwikkelingsstadia.
In dit artikel beschrijven we hoe we de AFM gebruiken om zowel de mechanische eigenschappen van de celwand als de turgor-druk te meten. Deze twee toepassingen worden gedemonstreerd op twee verschillende AFM microscopen en zijn hier gedetailleerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De opkomst van vormen in planten wordt voornamelijk bepaald door de gecoördineerde snelheid en richting van de groei tijdens tijd en ruimte. Plantencellen zijn omhuld in een rigide celwand gemaakt van een polysaccharidische matrix, die ze samen lijmen. Als gevolg hiervan wordt de celexpansie bestuurd door het evenwicht tussen turgor-druk trekken op de celwand en de stijfheid van de celwand die weerstand bieden aan deze druk. Om de mechanismen van de onderliggende ontwikkeling te begrijpen, is het belangrijk om zowel de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen het PLATIM team bedanken voor hun technische ondersteuning, evenals Arezki Boudaoud en leden van het Biophysic team in het RDP Lab voor nuttige discussies.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
