ここでは、細胞や組織に対してナノ・マイクロインデントツールとして動作する原子力顕微鏡(AFM)を紹介する。器械はサンプルの3D表面の地形および細胞壁ヤングの係数およびターゴール圧力を含む機械特性の同時獲得を可能にする。
ここでは、原子組織をインデントし、その機械的特性を回復するための原子間力顕微鏡の使用を提示します。インデントモードで2つの異なる顕微鏡を使用して、弾性率を測定し、それを使用して細胞壁の機械的特性を評価する方法を示します。また、ターゴル圧力の評価方法についても説明する。原子間力顕微鏡検査の主な利点は、非侵襲的で比較的迅速な(5〜20分)であり、表面的に平坦な生きている植物組織の事実上あらゆるタイプが治療を必要とせずに分析できることである。解像度は、先端のサイズと単位面積あたりの測定値の数に応じて、非常に良好なことができます。この方法の 1 つの制限は、表面的なセル層への直接アクセスのみを与える場合です。
原子力顕微鏡(AFM)は、スキャンプローブ顕微鏡(SPM)ファミリーに属し、通常数ナノメートルの半径を持つ先端がサンプルの表面をスキャンします。表面の検出は、光学式または電子ベースの方法ではなく、先端とサンプル表面との相互作用力によって達成される。したがって、この技術は、サンプル表面の地形特性解析(数ナノメートルまで下がることができる3D解像度)に限定されるだけでなく、静電、ファンデルワールス、接触力などのあらゆるタイプの相互作用力の測定も可能です。さらに、先端は、生体試料の表面に力を加え、得られた変形、いわゆる「インデント」を測定し、その機械的特性(例えば、ヤングの係数、粘弾性特性)を決定するために使用することができる。
植物細胞壁の機械的特性は、発達過程1、2、3の基礎となるメカニズムを理解しようとする際に考慮することが不可欠である。実際、これらの特性は、細胞が成長することを可能にするために細胞壁軟化が必要とされるので、特に、発達中に厳密に制御される。AFMは、これらの特性を測定し、臓器、組織または発達段階の間で変化する方法を研究するために使用することができます。
本論文では,AFMを用いて細胞壁の機械的特性とターゴール圧の両方を測定する方法について述べた.これらの2つの適用は2つの異なったAFM顕微鏡で実証され、後でここで詳しく説明される。
植物の形状の出現は、主に時間と空間の間の成長の協調速度と方向によって決定されます。植物細胞は、それらを一緒に接着するポリサカリディックマトリックスで作られた硬質細胞壁に包まれています。その結果、細胞増殖は、細胞壁を引っ張るターゴール圧と、この圧力に抵抗する細胞壁の剛性との平衡によって制御される。発達の根底にあるメカニズムを理解するためには、特定の器?…
The authors have nothing to disclose.
PLATIMチームのテクニカルサポートに感謝するとともに、RDPラボのアレスキ・ブーダウドと生物物理学チームのメンバーに役立つディスカッションを行ってくださったことに感謝します。
Growth medium | |||
1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
Tools for AFM | |||
BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
Patafix | UHU | D1620 | |
Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |