Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil
Summary
Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.
Abstract
Protein çevirisinin başlatılması aşamasında, ribozom mRNA ‘nın başlatma bölgesine bağlanır. Tercüme başlatma, bir RNA bağlayıcı proteinin (RBP) mRNA ‘nın başlama bölgesine bağlanması ile bloke edilebilir, bu da ribozom bağlayıcılığı ile müdahale eder. Sunulan yöntemle, bu engelleme fenomenini, RBPs ‘in bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelerine bağlayıcı benzeşimini ölçmek için kullanıyoruz. Bunu yapmak için bir muhabir mRNA başlatma bölgesinde bir test bağlama sitesi ekleyin ve test RBP ifadesine neden. RBP-RNA bağlayıcı durumunda, RBP konsantrasyonunun bir işlevi olarak gazetecinin ifadesinin sigmoidal baskının gözlemlendiği görülmüştür. Bağlayıcı site ile RBP arasında yakınlık yok veya çok düşük bir yakınlık durumunda önemli bir baskı görülmemiştir. Yöntem canlı bakteriyel hücrelerde gerçekleştirilir ve pahalı veya sofistike makineler gerektirmez. Bir dizi tasarlanmış bağlayıcı site için bakterilerde işlevsel olan farklı RBPs ‘in bağlayıcı ekfeleri arasında ölçülmesi ve karşılaştırılması için yararlıdır. Bu yöntem, yüksek yapısal karmaşıklık içeren siteler bağlama için uygun olmayabilir. Bu RBP yokluğunda karmaşık mRNA yapısı tarafından ribozomal inisiyasyon baskının olasılığı nedeniyle, hangi alt bazal muhabir gen ifade neden olur, ve böylece RBP bağlayıcı üzerine daha az gözlemlenebilir muhabir baskı.
Introduction
RNA bağlayıcı protein (RBP) tabanlı post-transcriptional düzenleme, özellikle RBPs ve RNA arasındaki etkileşimi karakterize, son yıllarda yaygın olarak incelenmiştir. Rbps inhibe kaynaklanan bakterilerde translasyonel aşağı-düzenleme birden fazla örnek vardır, ya da doğrudan rakip, ribozom bağlayıcı1,2,3. Sentetik biyoloji alanında, RBP-RNA etkileşimleri transkripsiyon bazlı genetik devreler4,5tasarımı için önemli bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, bir hücresel bağlamda bu tür RBP-RNA etkileşimlerini karakterizasyonu için talep bir artış vardır.
Protein-RNA etkileşimlerini incelemek için en yaygın yöntemler, in vitro ayarlarla sınırlı olan elektroforetik hareketlilik vardiya tahlil (EmSa)6‘ dır ve klip yöntemi de dahil olmak üzere çeşitli çekme testi7,8,9 . Bu tür yöntemler de Novo RNA bağlayıcı sitelerin keşfi etkinleştirmek iken, onlar emek yoğun protokoller ve pahalı derin sıralı reaksiyonlar gibi dezavantajları muzdarip ve RBP Pull-Down için belirli bir antikor gerektirebilir. RNA ‘nın çevreye duyarlı doğası nedeniyle, birçok faktör RBP-RNA etkileşimlerini etkileyebilir ve hücresel bağlamda RBP-RNA bağlayıcılığı sorgulayanın önemini vurgulıyor. Örneğin, biz ve başkaları RNA yapıları arasında vivo ve in vitro10,11arasında önemli farklar göstermiştir.
Bir önceki çalışmanın yaklaşımı dayanarak12, biz Geçenlerde göstermiştir10 bu zaman önceden hazırlanmış bağlayıcı siteleri için kapsid rbps Bakteriyofajlar GA13, MS214, PP715, ve qβ16 bir muhabir mRNA çevirisi başlatma bölgesi, muhabir ifade güçlü bastırılmış. RBPs ile ilgili RNA bağlayıcı sitesis in vivo arasındaki benzeşimini ölçmek için, bu baskı fenomenine dayanan nispeten basit ve nicel bir yöntem sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntem, E. coli HÜCRELERINDE RBP-RNA bağlama benzeşiminin nicel in vivo ölçümünü kolaylaştırır. Protokol nispeten kolay ve sofistike makineler kullanmadan yapılabilir, ve veri analizi basittir. Dahası, sonuçlar, sonraki nesil sıralama (NGS) sonuçları ile ilişkili nispeten uzun bekleme süresi olmadan hemen üretilir.
Bu yönteme bir sınırlama sadece bakteriyel hücrelerde çalışır olmasıdır. Ancak, bir önceki çalışma<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, planlama ve bütçeleme Komitesi ve Israil Bilim Vakfı (Grant No. 152/11), Marie Curie Reentegrasyon Grant No ı-CORE programı fon aldı. PCIG11-GA-2012-321675, ve Avrupa Birliği ‘nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı No. 664918-MRG-dilbilgisi Grant anlaşması altında.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
- . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
- . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
- . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
- . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
- . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
- . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
