Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën
Summary
Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp’s) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.
Abstract
In de initiatie stap van eiwit vertaling bindt het ribosoom aan het initiatie gebied van de mRNA. Initiatie van de vertaling kan worden geblokkeerd door binding van een RNA bindend eiwit (RBP) aan de initiatie regio van de mRNA, die interfereert met ribosoom binding. In de gepresenteerde methode gebruiken we dit blokkerende fenomeen om de bindende affiniteit van rbp’s te kwantificeren naar hun verwant en niet-verwant binding sites. Om dit te doen, voegen we een test binding site in het initiatie gebied van een reporter mRNA en induceren de uitdrukking van de test RBP. In het geval van RBP-RNA binding, observeerden we een sigmoïdale onderdrukking van de reporter expressie als een functie van RBP-concentratie. In het geval van geen affiniteit of een zeer lage affiniteit tussen de bindingsplaats en de RBP, werd geen significante onderdrukking waargenomen. De methode wordt uitgevoerd in levende bacteriële cellen, en vereist geen dure of verfijnde machines. Het is nuttig voor het kwantificeren en vergelijken van de bindende verwantschap van verschillende Rbp’s die functioneel zijn in bacteriën tot een set van ontworpen binding sites. Deze methode kan ongeschikt zijn voor binding sites met een hoge structurele complexiteit. Dit is te wijten aan de mogelijkheid van onderdrukking van de ribosomale initiatie door complexe mRNA-structuur in de afwezigheid van RBP, wat zou resulteren in een lagere basale reporter genexpressie, en dus minder waarneembare reporter onderdrukking bij RBP binding.
Introduction
RNA binding protein (RBP)-gebaseerde post-transcriptionele regulatie, specifiek karakteriseren van de interactie tussen Rbp’s en RNA, is in de afgelopen decennia uitgebreid bestudeerd. Er zijn meerdere voorbeelden van translationele down-regulatie in bacteriën afkomstig van rbps remming, of rechtstreeks concurreren met, ribosoom binding1,2,3. Op het gebied van de synthetische biologie, RBP-RNA interacties ontstaan als een belangrijk instrument voor het ontwerp van op transcriptie gebaseerde genetische circuits4,5. Daarom is er een toename van de vraag naar karakterisering van zulke RBP-RNA-interacties in een cellulaire context.
De meest voorkomende methoden voor het bestuderen van eiwit-RNA-interacties zijn de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)6, die beperkt is tot in vitro-instellingen, en verschillende pull-down testen7, inclusief de clip methode8,9 . Hoewel dergelijke methoden de ontdekking van de Novo RNA binding sites mogelijk maken, lijden ze aan nadelen zoals arbeidsintensieve protocollen en dure Deep sequence-reacties en kunnen ze een specifiek antilichaam voor RBP-pull-down vereisen. Vanwege de gevoelige aard van RNA in zijn omgeving, kunnen veel factoren invloed hebben op RBP-RNA-interacties, waarbij het belang van het ondervragen van RBP-RNA-binding in de cellulaire context wordt benadrukt. Zo hebben wij en anderen aanzienlijke verschillen aangetoond tussen de RNA-structuren in vivo en in vitro10,11.
Op basis van de aanpak van een eerdere studie12, hebben we onlangs10 aangetoond dat bij het plaatsen van vooraf ontworpen binding sites voor de capside rbps van de bacteriofagen ga13, ms214, PP7-15en qβ16 in de Vertaal initiatie regio van een reporter mRNA, reporter expressie wordt sterk onderdrukt. We presenteren een relatief eenvoudige en kwantitatieve methode op basis van dit repressie fenomeen om de affiniteit tussen Rbp’s en hun corresponderende RNA bindingsplaatss in vivo te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit artikel beschreven methode vergemakkelijkt kwantitatieve in vivo meting van RBP-RNA bindingsaffiniteit in E. coli cellen. Het protocol is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van geavanceerde machines, en data-analyse is eenvoudig. Bovendien worden de resultaten onmiddellijk geproduceerd, zonder de relatief lange wachttijd in verband met de volgende generatie sequencing (NGS) resultaten.
Een beperking van deze methode is dat het alleen in bacteriël…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project ontving financiering uit het I-CORE-programma van het plannings-en budgetterings Comité en de Israel Science Foundation (Grant nr. 152/11), Marie Curie re-integratie subsidie nr. PCIG11-GA-2012-321675, en van het Horizon 2020 onderzoeks-en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 664918-MRG-grammatica.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
- . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
- . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
- . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
- . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
- . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
- . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
