في هذه الطريقة، نقوم بتحديد التقارب الملزم للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) إلى مواقع ربط الكُونات وغير الكونيات باستخدام اختبار مراسل بسيط ومباشر في الخلايا البكتيرية. ويستند هذا القول على قمع جين مراسل.
في خطوة بدء ترجمة البروتين، يرتبط الريبوسم بمنطقة بدء mRNA. يمكن حظر بدء الترجمة عن طريق ربط بروتين ملزم الحمض النووي الريبي (RBP) إلى منطقة بدء mRNA، الذي يتداخل مع ربط ريبوسم. في الطريقة المعروضة، نستخدم هذه الظاهرة حجب لتحديد مدى التقارب ملزمة من RBPs إلى مواقعها ملزمة cognate وغير cognate. للقيام بذلك، نقوم بإدراج موقع ربط اختبار في منطقة بدء mRNA مراسل والحث على التعبير عن RBP الاختبار. وفي حالة ربط RBP-RNA، لاحظنا قمعاً السينياً للتعبير الصحفي كدالة لتركيز الممارسات التجارية التقييدية. وفي حالة عدم وجود تقارب أو تقارب منخفض جداً بين الموقع الملزم والممارسات التجارية التقييدية، لم يلاحظ أي قمع كبير. يتم تنفيذ هذه الطريقة في الخلايا البكتيرية الحية، ولا تتطلب آلات مكلفة أو متطورة. ومن المفيد تحديد الخصائص والمقارنة بين أوجه التقارب الملزمة لمختلف الممارسات التجارية التقييدية التي تعمل في البكتيريا إلى مجموعة من مواقع الربط المصممة. قد يكون هذا الأسلوب غير مناسب للمواقع الملزمة ذات التعقيد الهيكلي العالي. ويرجع ذلك إلى إمكانية قمع بدء ريبوسومال من قبل هيكل MRNA معقدة في غياب RBP، مما يؤدي إلى التعبير الجيني مراسل القاعدية أقل، وبالتالي قمع مراسل أقل ملاحظة على ربط RBP.
وقد تمت دراسة اللوائح القائمة على البروتين الملزم للRNA (RBP) بعد النسخ، وعلى وجه التحديد توصيف التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي، على نطاق واسع في العقود الأخيرة. هناك أمثلة متعددة من التنظيم أسفل الترجمة في البكتيريا الناشئة من RBPs تثبيط،أو تتنافس مباشرة مع، الريبوسم ملزمة 1،2،3. في مجال البيولوجيا التركيبية، تظهر تفاعلات RBP-RNA كأداة هامة لتصميم الدوائر الوراثية المستندة إلى النسخ4و5. ولذلك، هناك زيادة في الطلب على توصيف هذه التفاعلات بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي في سياق خلوي.
الطرق الأكثر شيوعا لدراسة التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي هي تحويل التنقل الكهربائي (EMSA)6، والذي يقتصر على إعدادات المختبر ، ومختلف الاختبارات المنسدلة7، بما في ذلك طريقة CLIP8،9 . في حين أن هذه الأساليب تمكن من اكتشاف مواقع الربط الحمض النووي الريبي دي نوفو, أنها تعاني من عيوب مثل بروتوكولات كثيفة العمالة وردود الفعل التسلسل العميق مكلفة وقد تتطلب جسم اضدي معين لRBP المنسدلة. بسبب الطبيعة القابلة للتأثر من الحمض النووي الريبي لبيئتها، يمكن أن تؤثر عوامل كثيرة على تفاعلات RBP-RNA، مع التأكيد على أهمية استجواب RBP-RNA ملزمة في السياق الخلوي. على سبيل المثال، لقد أظهرنا نحن وآخرون اختلافات كبيرة بين هياكل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي وفي المختبر10،11.
استنادا ً إلى نهج دراسة سابقة12، أظهرنا مؤخرا10 أنه عند وضع مواقع ملزمة مصممة مسبقا للRBPs كابسيد من البكتيريا GA13، MS214، PP715، وQβ16 في ترجمة بداية منطقة من مراسلة [مرنا], مراسلة قمعت تعبير بقوّة. نحن نقدم طريقة بسيطة وكمية نسبيا، استنادا إلى هذه الظاهرة القمع، لقياس التقارب بين RBPs وما يقابلها RNA موقع ملزمs في الجسم الحي.
الطريقة الموصوفة في هذه المقالة يسهل القياس الكمي في الجسم الحي من تقارب ربط RBP-RNA في خلايا القولونية E. والبروتوكول سهل نسبيا ويمكن إجراؤه دون استخدام آلية متطورة، وتحليل البيانات واضح. وعلاوة على ذلك، تُنتج النتائج على الفور، دون وقت الانتظار الطويل نسبيا المرتبط بنتائج الجيل التال?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تلقى هذا المشروع تمويلا ً من برنامج I-CORE التابع للجنة التخطيط والميزنة ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 152/11)، والمنحة رقم ماري كوري لإعادة الإدماج. PCIG11-GA- 2012-321675، ومن برنامج أبحاث وابتكار أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 664918 – MRG-Grammar.
Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
ApaLI | NEB | R0507 | |
Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
Eagl-HF | NEB | R3505 | |
glycerol | BIO LAB | 071205 | |
incubator | TECAN | liconic incubator | |
Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
KpnI- HF | NEB | R0142 | |
ligase | NEB | B0202S | |
liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
Matlab analysis software | Mathworks | ||
multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
Tryptone | BD | 211705 |