Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien
Summary
Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.
Abstract
Im Initiationsschritt der Proteintranslation bindet das Ribosom an den Initiationsbereich der mRNA. Die Translationsinitiation kann durch Bindung eines RNA-bindenden Proteins (RBP) an den Initiationsbereich der mRNA blockiert werden, der die Ribosome-Bindung stört. In der vorgestellten Methode nutzen wir dieses Blockierungsphänomen, um die Bindungsaffinität von RBPs zu ihren kognitierten und nicht kognierten Bindungsstellen zu quantifizieren. Dazu fügen wir eine Testbindungsstelle im Initiationsbereich einer Reporter-mRNA ein und induzieren die Expression des Test-RBP. Bei der RBP-RNA-Bindung beobachteten wir eine sigmoidale Unterdrückung des Reporterausdrucks als Funktion der RBP-Konzentration. Bei no-affinity oder sehr geringer Affinität zwischen Bindungsseite und RBP wurde keine signifikante Repression beobachtet. Die Methode wird in lebenden Bakterienzellen durchgeführt und erfordert keine teuren oder ausgeklügelten Maschinen. Es ist nützlich für die Quantifizierung und den Vergleich zwischen den Bindungsaffinitäten verschiedener RBPs, die in Bakterien funktionsfähig sind, zu einer Reihe von entworfenen Bindungsstellen. Diese Methode kann für die Bindung von Standorten mit hoher struktureller Komplexität ungeeignet sein. Dies ist auf die Möglichkeit der Unterdrückung der ribosomalen Initiation durch komplexe mRNA-Struktur in Abwesenheit von RBP zurückzuführen, was zu einer niedrigeren Basalreporter-Genexpression und damit zu einer weniger beobachtbaren Reporterrepression auf DIE RBP-Bindung führen würde.
Introduction
Die RNA-bindende Protein-basierte posttranskriptionelle Regulation, speziell die Charakterisierung der Interaktion zwischen RBPs und RNA, wurde in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht. Es gibt mehrere Beispiele für translationale Down-Regulierung bei Bakterien, die von RBPs stammen, die Ribosombindung1,2,3hemmen oder direkt mit ihnen konkurrieren. Im Bereich der synthetischen Biologie entwickeln sich RBP-RNA-Wechselwirkungen zu einem bedeutenden Werkzeug für die Entwicklung von Transkriptionsbasierten genetischen Schaltkreisen4,5. Daher steigt die Nachfrage nach Charakterisierung solcher RBP-RNA-Wechselwirkungen im zellulären Kontext.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen sind der elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA)6, der auf In-vitro-Einstellungen beschränkt ist, und verschiedene Pull-Down-Assays7, einschließlich der CLIP-Methode8,9 . Während solche Methoden die Entdeckung von de novo RNA-Bindungsstellen ermöglichen, leiden sie unter Nachteilen wie arbeitsintensiven Protokollen und teuren tiefen Sequenzierungsreaktionen und erfordern möglicherweise einen spezifischen Antikörper für RBP-Pull-down. Aufgrund der anfälligen Natur der RNA für ihre Umgebung können viele Faktoren RBP-RNA-Wechselwirkungen beeinflussen, was die Bedeutung der Rekation der RBP-RNA-Bindung im zellulären Kontext unterstreicht. Zum Beispiel haben wir und andere signifikante Unterschiede zwischen RNA-Strukturen in vivo und in vitro10,11gezeigt.
Basierend auf dem Ansatz einer früheren Studie12, haben wir vor kurzem10 gezeigt, dass bei der Platzierung vorgefertigter Bindungsstellen für die Kapsid-RBPs aus den Bakteriophagen GA13, MS214, PP715und Q.16 in der ÜbersetzungInitiationsregion eines Reporters mRNA, Reporter Ausdruck wird stark unterdrückt. Wir präsentieren eine relativ einfache und quantitative Methode, basierend auf diesem Repressionsphänomen, um die Affinität zwischen RBPs und ihrer entsprechenden RNA-Bindungsstelle in vivo zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel beschriebene Methode erleichtert die quantitative In-vivo-Messung der RBP-RNA-Bindungsaffinität in E. coli-Zellen. Das Protokoll ist relativ einfach und kann ohne den Einsatz ausgeklügelter Maschinen durchgeführt werden, und die Datenanalyse ist einfach. Darüber hinaus werden die Ergebnisse sofort erstellt, ohne die relativ lange Wartezeit, die mit den Ergebnissen der Next Generation Sequencing (NGS) verbunden ist.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde aus dem I-CORE-Programm des Planungs- und Budgetierungsausschusses und der Israel Science Foundation (Grant No. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 664918 – MRG-Grammar.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
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