Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri
Summary
In questo metodo, quantifichiamo l’affinità legante delle proteine leganti l’RNA (RBP) per cognare e siti di legame non-cognati utilizzando un semplice, dal vivo, saggio reporter nelle cellule batteriche. Il saggio si basa sulla repressione di un gene reporter.
Abstract
Nella fase di avvio della traduzione delle proteine, il ribosoma si lega alla regione di avvio dell’mRNA. L’avvio della traduzione può essere bloccato legando una proteina legante RNA (RBP) alla regione di avvio dell’mRNA, che interferisce con il legame ribosomico. Nel metodo presentato, utilizziamo questo fenomeno di blocco per quantificare l’affinità vincolante degli RBP ai loro siti di legame cognati e non cognati. Per fare questo, inseriamo un sito di rilegatura di test nell’area di avvio di un mRNA reporter e induciamo l’espressione del test RBP. Nel caso dell’associazione RBP-RNA, abbiamo osservato una repressione sigmoidale dell’espressione dei reporter in funzione della concentrazione di RBP. Nel caso di nessuna affinità o di affinità molto bassa tra sito vincolante e RBP, non è stata osservata alcuna repressione significativa. Il metodo viene eseguito in cellule batteriche vive e non richiede macchinari costosi o sofisticati. È utile per quantificare e confrontare tra le affinità di legame di diversi RBP che sono funzionali nei batteri con una serie di siti di legame progettati. Questo metodo può essere inappropriato per i siti di rilegatura con elevata complessità strutturale. Ciò è dovuto alla possibilità di repressione dell’avvio ribosomico da parte di una complessa struttura di mRNA in assenza di RBP, che si tradurrà in una minore espressione genica del reporter basale, e quindi meno conlacuabile repressione dei reporter sul legame RBP.
Introduction
Negli ultimi decenni la regolazione post-trascrizione basata sulla proteina legante dell’RNA (RBP), in particolare la caratterizzazione dell’interazione tra RBP e RNA, è stata ampiamente studiata negli ultimi decenni. Ci sono diversi esempi di down-regolazione traslazionale nei batteri originari di RBP che inibiscono, o direttamente in competizione con, ribosoma legame1,2,3. Nel campo della biologia sintetica, le interazioni RBP-RNA stanno emergendo come uno strumento significativo per la progettazione di circuiti genetici basati sulla trascrizione4,5. Pertanto, c’è un aumento della domanda di caratterizzazione di tali interazioni RBP-RNA in un contesto cellulare.
I metodi più comuni per studiare le interazioni proteina-RNA sono l’analisi elettroforica del cambio di mobilità (EMSA)6, che è limitato alle impostazioni in vitro, e vari saggi pull-down7, tra cui il metodo CLIP8,9 . Mentre tali metodi consentono la scoperta di siti di legame de novo RNA, soffrono di inconvenienti come protocolli ad alta intensità di lavoro e costose reazioni di sequenziamento profondo e possono richiedere un anticorpo specifico per il pull-down RBP. A causa della natura suscettibile dell’RNA al suo ambiente, molti fattori possono influenzare le interazioni RBP-RNA, sottolineando l’importanza di interrogare il legame RBP-RNA nel contesto cellulare. Ad esempio, noi e altri abbiamo dimostrato differenze significative tra le strutture di RNA in vivo e in vitro10,11.
Sulla base dell’approccio di uno studio precedente 12, abbiamo recentemente dimostrato10 che quando si posizionano siti di legame pre-progettati per gli RBP capsidi dei batteriofages GA13, MS214, PP715e Q regione di avvio della traduzione di un reporter mRNA, espressione reporter è fortemente repressa. Vi presentiamo un metodo relativamente semplice e quantitativo, basato su questo fenomeno di repressione, per misurare l’affinità tra gli RBP e il loro corrispondente sito di legame dell’RNAin vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo articolo facilita la misurazione quantitativa in vivo dell’affinità di legame RBP-RNA nelle cellule di E. coli. Il protocollo è relativamente semplice e può essere condotto senza l’uso di macchinari sofisticati e l’analisi dei dati è semplice. Inoltre, i risultati vengono prodotti immediatamente, senza il tempo di attesa relativamente lungo associato ai risultati di sequenziamento (NGS) di prossima generazione.
Una limitazione a questo metodo è che f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma I-CORE del Comitato di pianificazione e budgeting e dalla Israel Science Foundation (Grant no. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 e dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 664918 – MRG-Grammar.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
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