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Genetics

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

Published: June 12, 2019
doi:
10.3791/59611
, , , ,
1Department of Biotechnology and Food Engineering,Technion-Israel Institute of Technology, 2Russell Berrie Nanotechnology Institute,Technion-Israel Institute of Technology

Summary

この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。

Abstract

タンパク質翻訳の開始ステップでは、リボソームはmRNAの開始領域に結合する。翻訳開始は、リボソーム結合を妨げるmRNAの開始領域へのRNA結合タンパク質(RBP)の結合によって遮断されうる。提示された方法では、このブロッキング現象を利用して、その認知部位および非認知結合部位に対するRBPの結合親和性を定量化する。これを行うには、レポーターmRNAの開始領域に試験結合部位を挿入し、試験RBPの発現を誘導する。RBP-RNA結合の場合、RBP濃度の関数としてレポーター発現のシグモイド式の抑圧を観察した。結合部位とRBPとの間に親和性がないか、または非常に低い親和性の場合、有意な抑圧は認められなかった。この方法は、生きた細菌細胞で行われ、高価な機械や洗練された機械を必要としません。これは、細菌で機能する異なるBRBの結合親和性を、設計された結合部位のセットと定量化し、比較するのに有用である。この方法は、構造の複雑度が高い部位をバインドする場合には不適切な場合があります。これは、RBPが存在しない場合に複雑なmRNA構造によるリボソーム開始の抑圧の可能性に起因し、これは基底レポーター遺伝子発現を低下させ、したがってRBP結合時に観察可能なレポーターの抑圧をもたらす。

Introduction

RNA結合タンパク質(RBP)ベースの転写後調節、特にRBPとRNAとの相互作用の特徴付けは、ここ数十年で広範囲に研究されている。RbP阻害に起因する細菌における翻訳下調節の複数の例があり、または直接競合する、リボソーム結合1、2、3。合成生物学の分野では、RBP-RNA相互作用は転写ベースの遺伝回路4、5の設計のための重要なツールとして出現している。従って、このようなRBP-RNA相互作用の特性化に対する需要が細胞コンテキスト内で増加している。

タンパク質-RNA相互作用を研究するための最も一般的な方法は、インビトロ設定に限定される電気泳動シフトアッセイ(EMSA)6、およびCLIP法8、9を含む様々なプルダウンアッセイ7である。.このような方法は、デノボRNA結合部位の発見を可能にする一方で、労働集約的なプロトコルや高価な深いシーケンシング反応などの欠点に苦しんでおり、RBPプルダウンに対する特定の抗体を必要とする場合があります。RNAがその環境に対して感受性を持つため、多くの因子がRBP-RNA相互作用に影響を与える可能性があり、細胞コンテキストにおけるRBP-RNA結合を調知することの重要性を強調する。例えば、我々と他の人は、インビボとインビトロ10、11におけるRNA構造の間に有意な差を示した。

以前の研究12のアプローチに基づいて、我々は最近、バクテリオファージGA 13、MS214、PP715、およびQβ16からカプシドRBP用に事前に設計された結合部位を配置する際に10を実証した。レポーターmRNAの翻訳開始領域は、レポーター表現が強く抑圧されている。この抑圧現象に基づいて比較的単純で定量的な方法を提示し、生体内のRBPと対応するRNA結合部位との間の親和性を測定する。

Protocol

1. システムの準備 結合部位プラスミドの設計 図 1に示すように、バインディング サイト カセットを設計します。各ミニ遺伝子は、以下の部分(5’〜3′):Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5’末端の40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、5’末端の80塩基を含むmCherry遺伝子?…

Representative Results

提示された方法は、mRNA分子に結合するためのRBPとリボソームとの間の競争を利用する(図1)。この競争は、インデューサーの濃度の増加に起因するRBP-mCeruleanの生産増加の関数としてmCherryレベルを減少させることによって反映されます。mCerulean蛍光を増加させる場合、mCherryに有意な変化はなく、RBP結合の欠如が推測される。正と負のひずみの両方…

Discussion

本稿に記載の方法は、大腸菌細胞におけるRBP-RNA結合親和性の生体内測定を容易にする。プロトコルは比較的簡単で、高度な機械を使用せずに行うことができ、データ分析は簡単です。さらに、結果は、次世代シーケンシング(NGS)結果に関連する比較的長い待ち時間なしで、すぐに生成されます。

この方法の 1 つの制限は、細菌細胞でのみ動作することです。.しか?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、計画予算委員会のI-COREプログラムとイスラエル科学財団(助成金第152/11)、マリー・キュリー再統合助成金第1号から資金を受け取りました。PCIG11-GA- 2012-321675、および補助金契約第664918号の下で欧州連合のホライズン2020研究革新プログラムから – MRG-文法。

Materials

Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8- lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
glycerol BIO LAB 071205
incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
ligase NEB B0202S
liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705
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References

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Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).
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