この記事の目的は、メタボロミクス分析のために培養した付着細胞からの水性代謝産物の抽出のためのプロトコルを記述することであり、特に、毛細管電気泳動-質量分光法。
メタボロミクス分析は、正常細胞と比較してがん細胞の特定の代謝調節を理解するだけでなく、早期癌の発見や化学療法の反応予測のためのバイオマーカーの同定にも有望なオミクスアプローチです。癌患者メタボロミクス分析のための均一サンプルの準備は解決されるべき重大な問題である。ここでは、毛細血管電気泳動質量分析 (CE-MS) を用いたメタボロミクス解析のために、培養した付着細胞からの水性代謝物を抽出するための簡単で信頼性の高いプロトコルを紹介します。培養細胞からの水性代謝産物は、細胞の培養および洗浄、メタノールによる細胞の処理、代謝物の抽出、および CE MS 分析のためのスピンカラムを用いたタンパク質および高分子の除去によって分析されます。ビステアリルエチレンジアミドで処理された肺癌細胞株を用いた代表的な結果は、酸化的試薬であり、酸化ストレス下の細胞の明確に観察可能な代謝シフトを示す。この記事は、メタボロミクス研究に携わる学生や研究者にとって、CE MS による分析のために細胞株から代謝物を採取することが初めての場合に特に有益です。
オットー・ウォーバーグは、癌細胞がグルコースを取り、十分な酸素の存在下で乳酸を産生するために発酵する異常な能力を獲得することを観察した—ウォーバーグ効果または好気性解糖体1,2として呼ばれる現象。ミトコンドリア呼吸欠損は、癌細胞3における好気性解糖系の基礎として推測されている。実際、ウォーバーグ効果は、臨床実践4,5で広く使用されている fluorodeoxyglucose (FDG)-陽電子放射断層撮影 (PET) による腫瘍イメージングの基礎となっています。好気性解糖系の高い割合は癌の重要な特徴と考えられており、Hanahan やワインバーグ6で説明されているように、最近ではよく知られている「がんの特徴」の一つとして採用しています。癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における体性変異— HRAS/KRAS/NRAS、 EGFR、 BRAF、 MYC、 TP53、isocitrate 脱水素酵素 (IDH)、およびフマル酸プロホルモンコンバターゼ (FH) —癌細胞における特定の代謝変化にリンクされており、ウォーバーグ効果7の結果であると考えられる。
メタボロミクス分析は、がん細胞における代謝調節を理解するだけでなく、早期のがんバイオマーカーや化学療法の反応予測を明らかにするための有望なアプローチでもあります。抗癌化合物を有する感受性または抵抗性の癌細胞の治療に続いて、それらの代謝応答の追跡は、癌患者における特定の抗癌治療の有効性を予測する代謝バイオマーカーの同定を容易にする8 、9、10、11。この記事では、ビステアリルエチレンジアミドで処理されたEGFR突然変異を伴う肺腺癌 (酸化ストレスを引き起こす) に由来する癌細胞株をメタボロミクス分析のためのモデルとして使用した。キャピラリー電気泳動質量分析 (CE-MS) を使用したこの分析方法の利点は、質量範囲m/z 50-100012,13で荷電代謝物を包括的に測定できることです。この記事の目的は、初心者のために、培養癌細胞およびその後のメタボロミクス分析、特に CE MS による水性代謝産物の調製のための詳細なステップワイズ視覚プロトコルを提供することである。
ここでは、メタボロミクスをベースとした培養がん細胞から代謝物を調製するための、広くアクセス可能な方法論について述べる。このプロトコルの中で最も重要なポイントの1つは、測定された代謝物濃度が生存細胞数に対して正規化しているため、がん細胞を適切に調製することです。細胞数の正確な推定のためには、メタボロミクス分析のための代謝産物の抽出と並行して生存細胞数を数えるために実験群ごとに少なくとも1つの追加培養皿を調製する必要がある。さらに、同じ数の細胞は、反復のために、そして数えるための皿の各皿で播種されるべきです。将来的には、これは、同じ料理が生存細胞をカウントし、代謝物を抽出するために使用されることを可能にする迅速かつストレッサー (例えば、トリプシンフリーの) 細胞計数プロトコルによって助けられるであろう。細胞が食器の表面から剥離しないように、洗浄中は注意が必要です。重度の細胞毒性試験および細胞接着を減少させる他の実験は、洗浄手順の間の細胞の潜在的な損失によるこの抽出プロトコルには不適当であり得る。
PBS のような塩ベースのバッファーは、メタボロミクス分析を妨害し、測定に悪影響を及ぼすため、CE MS ベースのメタボロミクス分析のために培養細胞から代謝物を抽出するための洗浄バッファーとして、5% のマンニトール溶液を使用することが重要です。
2つまたは3つの皿は個々の皿からの代謝物をそれぞれ抽出し、次にサンプルをプールすることによって単一のサンプルとして結合することができる;しかし、複数の皿を組み合わせることは、抽出された代謝産物溶液中の残留マンニトールを増加させることが多い。これはまた、CE-MS によるメタボロミクス分析を妨げる可能性があります。したがって、単一のサンプルとして複数の料理や井戸を使用しないことをお勧めします。
このメタボロミクス分析法は、50 ~ 1000 Da の分子量を持つ荷電分子を包括的に測定するために開発されました。従って、この議定書は水様の、低分子量の混合物の抽出のために最大限に使用される。したがって、このプロトコールは、タンパク質および核酸のような脂質または高分子のような疎水性代謝産物の抽出には適さない。培養細胞試料の包括的脂質分析またはリピドミクスの要求が高まっていることから、親水性および疎水性代謝産物の同時抽出のための簡便で効果的なプロトコールの開発が必要とされている。
代謝物抽出の最初のステップ—培地の吸引と細胞をマンニトールで洗浄すること—細胞の代謝プロファイルへの変化を最小限に抑えるために、できるだけ早く行う必要があります。マンニトールによる洗浄後のメタノールによる細胞の治療は、タンパク質を変性させ、酵素がさらに代謝反応を触媒するのを防ぐことを前提としています。しかし、メタノール処理後でも、酸化還元反応、いくつかの脱カルボキシル化プロセス、チオール結合などの非酵素的化学反応が起こることがあります。このように、このプロトコルによって測定されたこれらの反応に関与する代謝物の任意の濃度は慎重に解釈する必要があります。このメタボロームは、ゲノムやトランスクリプトームとは対照的に、さまざまな化学的性質を持つ分子で構成されています。したがって、単一のプロトコルでは、損失や乱れなしにすべての代謝産物を抽出することはできません。このような反応性の高い代謝物をより正確に測定するためには、fractionations と derivatizations を必要とする特定の代謝産物群を抽出するように特別に設計されたプロトコルに相談する必要があります。ここで提示されるプロトコールは、CE − MS によるメタボロミクス分析のための培養細胞試料からの水性代謝産物の簡便かつ迅速な抽出を説明する。本稿では、現在の原稿の焦点が異なるので、CE を詳細に設定する方法については説明できませんでしたが、CE-MS をセットアップするための詳細な手順を説明するには、別の専用の記事が必要かもしれません。
The authors have nothing to disclose.
庄内地域産業振興センターの皆様のご協力に感謝いたします。この作品は、国立がん研究開発基金 (助成番号 28-9) による山形県と鶴岡市の研究資金によって部分的に支えられ、日本学術振興会 (科研費) によって助成17K07189」に HM。
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |