استخراج الأيض المائي من خلايا ملتصقة مثقفه للتحليل الأيضي بواسطة الكهربائي الكهربي-الطيف الكتلي

1-ثقافة الخلية في اليوم الأول ملاحظه: كل عينه لاستخراج المستقلب يجب ان تكون مستعدة من صحن واحد 100 الانسجه ملم الثقافة التي هي معتدله ولكن ليس تماما متموج (تحتوي علي ما يقرب من 2-5 مليون خليه). حساب عدد الاطباق اللازمة لفحص واعدادها وفقا لذلك. الثقافة HCC827 و PC-9 الخلايا في 5 ٪ CO2 في 37 درجه مئوية في rpmi-1640 المتوسطة المضافة مع المصل البقري الجنينية 10 ٪. يستنشق وسائل الاعلام الثقافة الخلية من الاطباق الثقافة 100 mm. غسل الخلايا علي كل طبق باستخدام 2 مل من الفوسفات المحلول الملحي مخزنه (تلفزيوني) محلول دون الكالسيوم والمغنيسيوم. صخره بلطف كل طبق بحيث الحل تلفزيوني يغطي تماما سطح الطبق. يستنشق المخزن المؤقت للغسيل من الاطباق الثقافية. الدافئة 0.25 ٪ تريبسين-أدتا الحل إلى 37 درجه مئوية وأضافه 2 مل من الحل تريبسين-أدتا مع ماصه 5 مل المصلية. صخره بلطف كل طبق بحيث التريبسين يغطي تماما سطح الطبق. احتضان الاطباق الثقافية في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق تقريبا. أضف 4 مل من متوسط النمو الكامل قبل التسخين لكل طبق. أعاده تعليق الخلايا في الوسط عن طريق الأنابيب برفق عده مرات. نقل كل تعليق خليه إلى أنبوب مخروطي 15 مل منفصلة وأجهزه الطرد المركزي في 800 × g لمده 5 دقائق. أعاده التعليق علي كل خليه بيليه في 2 مل من المتوسط النمو الكامل قبل حرارة. تحديد العدد الإجمالي والنسبة المئوية لبقاء الخلايا باستخدام عداد الخلايا المؤتمت و 0.4% الحل الأزرق التريبين. مزيج 10 μL من تعليق الخلية و 10 μL من 0.4% الحل الأزرق التريبين. تحميل 10 μL من عينه في خليه عد غرفه الشريحة من خلال العمل الشعرية. ادخل شريحة الحجرة في عداد الخلية المؤتمت. يضيء الضوء المرسل تلقائيا ويركز الجهاز تلقائيا علي الخلية. اضغط علي زر التقاط للتقاط الصورة وعرض النتائج. إذا لزم الأمر ، أضافه المزيد من النمو المتوسطة للحصول علي تركيز الخلية المطلوب. البذور ما يقرب من 1-2.5 مليون خليه لكل 100 مم طبق ثقافة الخلايا.ملاحظه: سيتم تطبيع تركيزات المستقلب التي يحددها تحليل CE-MS استنادا إلى عدد الخلايا القابلة للحياة. لغرض عد الخلايا ، من الضروري اعداد طبق واحد علي الأقل للثقافة المصنفة لكل مجموعه. احتضان الاطباق الثقافية في 5 ٪ CO2 في 37 درجه مئوية لمده 18 ساعة. 2. اعداد الكواشف تمييع الحل التجاري الداخلي القياسية بما في ذلك L-ميثيونين سولفون و d-الكافور-10-حمض السلفونيك 1000-اضعاف في المياه نقاء.ملاحظه: للحصول علي اقل من 80 العينات ، ببساطه مزيج 50 μl من الحل القياسي الداخلي 1 و 45 ml من المياه نقاء في قارورة الحجمي 50 mL ، ثم جلب الحل تصل إلى 50 ml مع المياه نقاء. اعداد 0.05 الحل مانيتول g/mL في المياه نقاء كما يغسل العازلة.ملاحظه: لأقل من 30 عينات ، ببساطه حل 25 غراما من مانيتول في 500 مل من الماء نقاء. مطلوب حوالي 15 مل من المخزن المؤقت للغسيل لكل طبق الثقافة 100 ملم ، لذلك اعداد كميه كافيه من العازلة غسل وفقا لعدد من العينات. 3. قبل غسل وحدات تصفيه الطرد المركزي ماصه 250 μl من الماء نقاء في كوب فلتر من كل وحده تصفيه الطرد المركزي (انظر جدول المواد).ملاحظه: مطلوب وحدتي تصفيه لكل نموذج. كاب وحدات تصفيه باحكام وأجهزه الطرد المركزي في 9,100 × ز في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق. تحقق من حجم كل الترشيح — في حاله تراكم الترشيح الكبير خلال الدورة القصيرة الاولي ، قد تكون وحده الفلتر معيبه. في هذه الحالة ، تجاهل وحده التصفية واستخدام وحده تصفيه جديده بدلا من ذلك. إغلاق أغطيه وحدات التصفية باحكام وأجهزه الطرد المركزي مره أخرى في 9,100 × ز في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. ضمان عدم بقاء الماء الفائق النقاء في اي من أكواب الفلتر ؛ أزاله الماء فائق النقاء المصفاة في كل أنبوب جمع مع ماصه وتجاهل.ملاحظه: لا تحاول أزاله المياه المتبقية في كوب فلتر مع ماصه لأنها قد تضر عامل التصفية. استبدل أكواب الفلتر في أنابيب التجميع الخاصة بها.ملاحظه: استخدام وحدات تصفيه الطرد المركزي في غضون ساعة منذ الفلاتر قد تصبح معطوبة عند التجفيف. 4-ثقافة الخلية في اليوم الثاني إخراج الاطباق الثقافة 100 mm من الحاضنة.ملاحظه: مده ثقافة الخلية الموصي بها هي 18 ساعة. يستنشق المتوسطة ثقافة الخلية من كل طبق الثقافة 100 ملم. أضافه 10 مل من المتوسطة ثقافة الخلية التي تشمل التركيزات المناسبة من المركبات أو المخدرات لكل طبق ، مع الحرص علي عدم إزعاج طبقه الخلية.ملاحظه: لأغراض العرض التوضيحي ، وأضاف نحن 10 μL من 250 mM diamide المذاب في تلفزيوني (التركيز النهائي من 250 μM) في هذه التجربة. احتضان الاطباق الثقافية في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في وجود diamide أو تلفزيوني كعنصر تحكم. يستنشق المتوسطة ثقافة الخلية من كل طبق الثقافة 100 ملم. غسل الخلايا عن طريق أضافه بلطف 2 مل من محلول مانيتول 5 ٪ إلى حافه كل طبق ، مع الحرص علي عدم إزعاج طبقه الخلية ، ثم أماله قليلا الطبق.ملاحظه: يتعارض المحلول التلفزيوني أو المحلول الملحي مع التحليل الأيضي المستند إلى MS ويؤثر سلبا علي نتائج القياس ، التالي لا ينبغي استخدامه كمخزن مؤقت للغسيل. يستنشق المخزن المؤقت للغسيل من كل طبق الثقافة ، ثم يغسل الخلايا مره أخرى عن طريق أضافه بلطف 10 مل من العازلة غسل لكل طبق ويميل قليلا الطبق. يستنشق تماما العازلة غسل من حافه كل طبق الثقافة.ملاحظه: يستنشق كما غسل المخزن المؤقت قدر الإمكان ، في حين التفات إلى عدم يستنشق الخلايا. قد تتداخل مانيتول المتبقية مع تحليل م-MS ؛ سوف شفط الخلايا إنقاص عدد الخلايا التالي تصبح مصدرا للخطا في تطبيع البيانات. 5. استخراج الأيض من الخلايا المستزرعة أضافه 800 μL من 99.7 ٪ الميثانول لكل طبق الثقافة. صخره بلطف كل طبق الثقافة ذهابا وإيابا لتغطيه سطحه بأكمله. اترك الاطباق في درجه حرارة الغرفة لمده 30 ثانيه. ببطء أضافه 550 μL من المحلول القياسي الداخلي المخفف لكل طبق من خلال غمر غيض من ماصه في الميثانول والأنابيب بلطف صعودا وهبوطا عده مرات. صخره بلطف كل طبق الثقافة ذهابا وإيابا لتغطيه سطحه بأكمله. اترك الاطباق في درجه حرارة الغرفة لمده 30 ثانيه. 6. الترشيح الفائق لمقتطفات الخلايا نقل المحلول المستخرج من كل طبق الثقافة إلى منفصلة 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي أنابيب في 2,300 × ز في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق. نقل 350 μl من كل ماده طافي إلى وحدتين فلتر الطرد المركزي لكل عينه.ملاحظه: من كل طبق الثقافة ، يتم نقل ما مجموعه 700 μL من المحلول المستخرج إلى اثنين من أنابيب التصفية (350 μL/tube). الطرد المركزي أنابيب فلتر في 9,100 × ز في 4 درجه مئوية لمده 2 ساعة تقريبا حتى لا يبقي السائل في أكواب فلتر. قم بازاله أكواب الفلتر واغلق أغطيه أنابيب التجميع باحكام. 7. عينه التبخر اعداد المبخر الطرد المركزي-عاده ، وهذا يتكون من المبخر ، فخ الباردة ، ومضخة فراغ. وضع أنابيب جمع في المبخر الطرد المركزي.ملاحظه: اترك أغطيه الأنابيب مفتوحة. تتبخر الحلول عينه المستخرجة تحت ظروف فراغ في درجه حرارة الغرفة.ملاحظه: التكوينات النموذجية لعدد من التناوب والضغط هي 1,500 لفه في الدقيقة و 1,000 باسكال ، علي التوالي ، وعاده ما يستغرق حوالي 3 ح لتتبخر تماما العينات. تاكد من ان اي سائل لا يزال في اي من أنابيب جمع وإغلاق أغطيه الأنابيب باحكام. تخزين أنابيب جمع في درجه حرارة منخفضه جدا (− 80 درجه مئوية) الفريزر العميق حتى تحليل الأيض. 8. تحليل الأيض بواسطة م-MS أعاده تعليق الترشيح في 50 μl من الماء نقاء مباشره قبل CE-MS التحليل. اجراء تحليل ce-ms عن طريق الأساليب الموصوفة سابقا12,13 باستخدام نظام الكهربائي الشعرية والوقت من الطيران نظام مطياف الكتلة مجهزه مضخة اسقراطيه, محول م-ms, والبخاخ ce-ESI-ms.ملاحظه: كلا النظامين يمكن التحكم بها من قبل البرنامج من البائعين وترتبط بواسطة الشعرية السيليكا تنصهر (50 μm القطر الداخلي × 80 سم طول الإجمالي). اعداد الاداات وقنينات عينه ، واعداد الشعرية مع كاسيت الشعرية ، وتجديد السوائل غمد والمخازن المؤقتة الكهربائية المناسبة اعتمادا علي انيون أو وضع تحليل الموجبة ، ومن ثم تطبيق الفولتية.ملاحظه: الاجهزه والظروف التحليلية موصوفه بالتفصيل في مكان آخر12،13. فتح البرنامج واعداد قائمه العمل التي تحتوي علي أساليب الحصول علي البيانات وعينه المعلومات. بدء تشغيل اختبار والتحقق من البيانات مثل كثافة الاشاره وشكل ذروه المعايير الداخلية ودقه الذروة من المركبات القياسية الأخرى. صقل الظروف التحليلية إذا لزم الأمر. حقن نموذج الحلول في 50 ميليبار لمده 3 ليالي والجهد من 30 كيلو فولت.ملاحظه: تم اجراء CE-MS اما في وضع أيون ايجابيه أو سلبيه. تعيين مطياف لمسح نطاق كتله m/z 50-1000. تم تعيين الجهد الشعرية في 4 kV; معدل تدفق غاز النيتروجين (درجه حرارة السخان 300 درجه مئوية). النسبة للوضع الإيجابي ، تم تعيين الموجه المجزاه ، والمقشده ، والجهد الكهربي في 75 ، 50 و 125 فولت علي التوالي. لوضع الأيونات السالبة ، تم تعيين fragmentor ، مقشده ، و OCT RFV الجهد في 100 ، 50 ، و 200 V ، علي التوالي. تحليل بيانات الطيف. استخراج القمم من البيانات الطيفية الشاملة باستخدام برامج التكامل التلقائي من أجل الحصول علي معلومات الذروة بما في ذلك m/z، منطقه الذروة ، ووقت الهجرة (MT).ملاحظه: يتم وصف الأسلوب بالتفصيل في مكان آخر14. استبعاد القمم اشاره المقابلة لنظائرها ، أيونات القناة ، وأيونات المنتجات الأخرى من نواتج الأيض المعروفة. أضافه تعليقات إلى القمم المتبقية مع معلومات من قاعده بيانات المستقلب HMT وفقا لقيم m/z و MTs. تطبيع المناطق من القمم المشروحة إلى مستويات القياسية الداخلية واعداد الخلايا لكل عينه. تقييم تركيز كل المستقلب في الخلايا المستزرعة (pmol/106 خلايا) باستخدام المنحنيات القياسية المعدة لكل المستقلب. استخدام تركيزات المستقلب الكمية للتحليلات الاحصائيه اللاحقة والتفسيرات البيولوجية14.