Der Zweck dieses Artikels ist es, ein Protokoll für die Extraktion von wässrigen Metaboliten aus kultivierten, anhaftenden Zellen für die metabolomische Analyse zu beschreiben, insbesondere die kapillare Elektrophoresen-Massenspektrometrie.
Die metabolomische Analyse ist ein vielversprechender Omik-Ansatz, um nicht nur die spezifische Stoffwechselregulation in Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen zu verstehen, sondern auch Biomarker für die Krebserkennung und Vorhersage von Chemotherapie-Reaktionen im Frühstadium zu identifizieren. Krebspatienten. Die Vorbereitung einheitlicher Proben für die metabolomische Analyse ist ein kritisches Thema, das noch angegangen werden muss. Hier stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Gewinnung wässriger Metaboliten aus kultivierten, haftenden Zellen zur metabolomischen Analyse vor, die mittels der kapillaren Elektrophoresen-Massenspektrometrie (CE-MS) verwendet wird. Wässrige Metaboliten aus kultivierten Zellen werden durch Kultivierungs-und Waschzellen analysiert, Zellen mit Methanol behandelt, Metaboliten extrahiert und Proteine und Makromoleküle mit Spinnspalten für die CE-MS-Analyse entfernt. Repräsentative Ergebnisse mit Hilfe von Lungenkrebszelllinien, die mit Diamid behandelt werden, einem oxidativen Reagenz, zeigen die deutlich beobachtbare Stoffwechselverschiebung von Zellen unter oxidativem Stress. Dieser Artikel wäre besonders wertvoll für Studenten und Forscher, die an der Metabolomik-Forschung beteiligt sind, die neu sind, um Metaboliten aus Zelllinien zu ernten, um sie von CE-MS zu analysieren.
Otto Warburg beobachtete, dass Krebszellen die ungewöhnliche Fähigkeit erlangen, Glukose aufzunehmen und sie zu gären, um Laktat in Gegenwart von ausreichend Sauerstoff zu produzieren — ein Phänomen, das als Warburg-Effekt oder Aerobic-Glykolyse1,2bezeichnet wird. Als Grundlage für die aeroben Glykolyse in Krebszellen 3 werden mitochondriale Atemdefekte spekuliert. Tatsächlich ist der Warburg-Effekt die Grundlage für die Tumorabbildung durch Fluorodeoxyglukose (FDG)-Positronen-Emissionstomographie (PET), die in der klinischen Praxis4,5weitverbreitet ist. Eine hohe Aerobic-Glykolysegiltals ein wesentliches Merkmal von Krebs und wurde vor kurzem als eines der bekannten “Kennzeichen von Krebs” angenommen, wie es D. Hanahan und B. Weinberg 6 beschrieben haben. Somatische Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen — wie HRAS/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, Isozitrat-Dydrierase (IDH) und Fumarathydratase (FH — mit spezifischen Stoffwechselveränderungen in Krebszellen in Verbindung gebracht wurden, die als Folge des Warburg-Effekts 7 gelten.
Die metabolomische Analyse ist ein vielversprechender Ansatz, nicht nur die Stoffwechselregulation in Krebszellen zu verstehen, sondern auch, um Biomarker im Frühstadium und die Vorhersage der Chemotherapie zu identifizieren. Nach der Behandlung sensibler oder resistenter Krebszellen mit Krebsmittelverbindungen ermöglicht die Verfolgung ihrer Stoffwechselreaktionen die Identifizierung von Stoffwechselbiomarkern, um die Wirksamkeit bestimmter Krebstherapien bei Krebspatienten vorherzusagen 88 ,9,10,11. In diesem Artikel wurden Krebszelllinien, die von einem Lungenadenokarzinom mit einer EGFR-Mutation abgeleitet sind, die mit Diamid — behandelt wird, die oxidativen Stress verursacht — als Modelle für die metabolomische Analyse verwendet wurden. Der Vorteil dieser analytischen Methode mit kapillarer Elektrophoresis-Massenspektrometrie (CE-MS) ist die umfassende Messung von geladenen Metaboliten mit dem Massenbereich m/50-1000 12,13. Der Zweck dieses Artikels ist es, den Novizen ein detailliertes stufenweises visuelles Protokoll zur Herstellung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Krebszellen und anschließender metabolomischer Analyse, insbesondere durch CE-MS, zu liefern.
Hier beschreiben wir eine allgemein zugängliche Methodik zur Vorbereitung von Metaboliten aus kultivierten Krebszellen auf die auf CE-MS basierende metabolomische Analyse. Einer der kritischsten Punkte in diesem Protokoll ist die richtige Aufbereitung von Krebszellen, da die gemessenen Stoffwechselkonzentrationen auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert werden. Für die genaue Abschätzung der Zellzahl ist es notwendig, mindestens ein zusätzliches Kulturgericht pro Experimentengruppe vorzubereiten, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen parallel zur Extraktion von Metaboliten für die metabolomische Analyse zu zählen. Darüber hinaus sollte in jedem Teller die gleiche Anzahl von Zellen für die Replikate und in der Schüssel für das Zählen gesät werden; In Zukunft würde dies durch ein schnelles und stressfreies (z.B. trypsinfreies) Zellzählprotokoll unterstützt, das es erlaubt, die gleiche Schale sowohl für das Zählen lebensfähiger Zellen als auch für den Abbau von Metaboliten zu verwenden. Bei der Wäsche sollte darauf geachtet werden, dass sich die Zellen nicht von der Oberfläche der Geschirr lösen. Schwere Zytotoxizitätstests und andere Experimente, die die Zellhaftung reduzieren, können für dieses Extraktionsprotokoll aufgrund eines möglichen Verlustes von Zellen während des Waschvorgangs ungeeignet sein.
Es ist wichtig, eine 5-prozentige Mannitol-Lösung als Waschpuffer für die Extraktion von Metaboliten aus kultivierten Zellen für die CE-MS-Basis mabolomische Analyse zu verwenden, da salzbasierte Puffer, wie PBS, die metabolomische Analyse stören und die Messung negativ beeinflussen.
Zwei oder drei Gerichte können als Einzelprobe kombiniert werden, indem man Metaboliten aus jeder Schüssel einzeln extrahiert und dann Proben bündelt; Die Kombination mehrerer Gerichte erhöht jedoch oft das Restmannitol in der extrahierten Metabolitenlösung. Dies kann auch die metabolomische Analyse durch CE-MS stören. Daher wird empfohlen, nicht mehrere Gerichte oder Brunnen als eine Probe zu verwenden.
Diese metabolomische Analysemethode mit CE-MS wurde für die umfassende Messung von geladenen Molekülen mit molekularen Gewichten zwischen 50 und 1000 Da entwickelt; So ist dieses Protokoll für die Extraktion von wässrigen, niedermolekularen Verbindungen optimiert. Daher eignet sich dieses Protokoll nicht für die Gewinnung hydrophobischer Metaboliten wie Lipide oder Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren. Da die Nachfrage nach umfassenden Lipidanalysen oder Lipidomics kultivierter Zellproben steigt, ist die Entwicklung eines einfachen und effektiven Protokolls zur gleichzeitigen Gewinnung von hydrophilen und hydrophobischen Metaboliten erforderlich.
Der erste Schritt der Stoffwechselextraktion — Aspirationsmedimine und Waschzellen mit Mannitol — sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um Veränderungen des Stoffwechselprofils der Zellen zu minimieren. Die Behandlung von Zellen mit Methanol nach dem Waschen mit Mannitol wird angenommen, um Proteine zu dichten und so zu verhindern, dass Enzyme weitere Stoffwechselreaktionen katalysieren. Doch auch nach der Methanolbehandlung können nicht-enzymatische chemische Reaktionen — wie Redoxreaktionen, einige Dekarboxylierungsprozesse und Thiolverbindungen — stattfinden. Daher sollten alle Konzentrationen von Metaboliten, die an diesen Reaktionen beteiligt sind, die durch dieses Protokoll gemessen werden, mit Vorsicht interpretiert werden. Im Gegensatz zum Genom oder Transkriptom besteht das Metabolom aus Molekülen mit einer Vielzahl chemischer Eigenschaften; Daher kann kein einzelnes Protokoll alle Metaboliten ohne Verlust oder Störung extrahieren. Für genauere Messungen solcher hochreaktiven Metaboliten sollte ein speziell entwickeltes Protokoll konsultiert werden, um bestimmte Stoffwechselgruppen zu extrahieren, die Fraktionierungen und Derivate erfordern. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt jedoch eine einfache und schnelle Extraktion wässriger Metaboliten aus kultivierten Zellproben für die metabolomische Analyse von CE-MS. In diesem Beitrag konnten wir nicht beschreiben, wie man CE-MS im Detail aufstellt, weil der Fokus des vorliegenden Manuskripts anders ist, aber die Beschreibung detaillierter Schritte zur Einrichtung von CE-MS kann einen separaten, dedizierten Artikel erfordern.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei allen Mitgliedern des Shonai Regional Industry Promotion Centers für ihre Hilfe. Diese Arbeit wurde unter anderem durch Forschungsmittel der Präfektur Yamagata und der Stadt Tsuruoka, durch den Forschungs-und Entwicklungsfonds des National Cancer Center [Grant-Nummer 28-A-9] und durch die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI unterstützt. 17K07189] bis HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |