המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.
ניתוח Metabolomic היא גישה מבטיחה omics לא רק להבין את התקנה מטבולית ספציפית תאים סרטניים לעומת תאים נורמליים אלא גם כדי לזהות סמנים ביואריטים לאיתור מוקדם בשלב הסרטן וחיזוי של תגובת כימותרפיה ב חולי סרטן. הכנת דגימות אחידה לניתוח metabolomic היא נושא קריטי שנותר לטפל בו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קל ואמין להפקת חילוף חומרים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic באמצעות אלקטרופורזה-המסה של הקפימטריה (CE-MS). מימית מטבוליטים מתאים מתורבתים מנותח על ידי culturing וכביסה תאים, טיפול בתאים עם מתנול, חילוץ מטבוליטים, והסרת חלבונים וקרו עם עמודות ספין עבור ניתוח CE-MS. תוצאות הנציג באמצעות קווי סרטן ריאות התאים שטופלו diamide, מגיב חמצוני, להמחיש את משמרת מטבולית בבירור הנצפה של תאים תחת לחץ חמצוני. מאמר זה יהיה יקר במיוחד לסטודנטים וחוקרים המעורבים במחקר טבולומיקס, מי הם חדשים לאסוף מטבוליטים מקווי התא לניתוח על ידי CE-MS.
אוטו ורבורג הבחין כי התאים הסרטניים לרכוש את היכולת יוצא דופן לקחת את הגלוקוז ולהחמיץ אותו כדי לייצר לקטט בנוכחות של חמצן הולם-תופעה כינה אפקט ורבורג או האירובי גליקוליזיס1,2. ליקויים בנשימה מיטוכונדריאלי הם העריכו כבסיס הבסיסי של גליקוליזיס אירובי בתאי סרטן3. אכן, אפקט ורבורג הוא בסיס הדמיה של הגידול על ידי פלואורודיט גלוקוז (fdg)-פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה (PET), אשר נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה קלינית4,5. שיעור גבוה של גליקולוליזיס אירובי נחשב לתכונה מרכזית של סרטן, שאומצה לאחרונה כאחת הידועות “הסימנים הידועים של סרטן”, כפי שמתואר על ידי ד. האנהאן ו ב ויינברג6. מוטציות סומטיים באואונגנים וגנים מדכא גידול-כגון HRAS/קראס/nras, egfr, braf, myc, TP53, isocitrate דהידרוגנאז (idh), ו fumarate הידרואטאז (fh ) — קושרו לשינויים מטבוליים ספציפיים בתאי הסרטן, האמינו כתוצאה מאפקט ורבורג7.
ניתוח Metabolomic היא גישה מבטיחה לא רק כדי להבין את הרגולציה המטבולית בתאים סרטניים אלא גם כדי לזהות מוקדם בשלב ביוארקרס סרטן וחיזוי תגובה כימותרפיה. בעקבות הטיפול של תאים סרטניים רגישים או עמידים עם תרכובות נוגדות סרטן, מעקב אחר תגובות מטבולית שלהם מקלה על זיהוי של בסמנים מטבוליים כדי לנבא את היעילות של טיפולים נוגדי סרטן ספציפיים בחולי סרטן8 ,9,10,11. במאמר זה, תא סרטן קווי נגזר אדנוקרצינומה ריאה עם מוטציה Egfr שטופלו diamide-מה שגורם לחץ חמצוני — שימשו מודלים עבור ניתוח metabolomic. היתרון של שיטה אנליטית זו באמצעות אלקטרופורזה-המסה ספקטרומטריה (CE-MS) הוא מדידה מקיפה של הטעונה מטבוליטים עם טווח מסה m/z 50-100012,13. מטרת מאמר זה היא לספק לטירונים פרוטוקול חזותי מפורט ויזואלי להכנת מטבוליטים מימית מתאי סרטן וניתוח metabolomic עוקבות, במיוחד על ידי CE-MS.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי להכין מטבוליטים מתאי סרטן מתורבת עבור ניתוח metabolomic מבוסס CE-MS. אחת הנקודות הקריטיות ביותר בפרוטוקול זה היא ההכנה הנכונה של תאים סרטניים, כי נמדד ריכוזי מטבוליזם לייט הם מנורמל למספר תאים קיימא. להערכת מדויק של מספר התא, יש להכין לפחות מנה אחת נוספת לתרבות לכל קבוצה ניסיונית כדי לספור את מספר התאים הקיימא במקביל עם החילוץ של מטבוליטים לניתוח metabolomic. בנוסף, יש לזרע את אותו מספר תאים בכל מנה עבור המשכפלת ובצלוחית לספירה; בעתיד, זה יהיה לסייע על ידי מהיר, ללא מלחיץ (למשל, טריפסין-ללא) פרוטוקול ספירת תאים המאפשר את הצלחת זהה לשמש הן לספור תאים קיימא ולחילוץ מטבוליטים. הטיפול צריך להילקח במהלך שוטף כך תאים לא להתנתק מהמשטח של הכלים. בדיקות ציטורעילות חמורה וניסויים אחרים הפחתת הדבקה בתאים עשויים להיות בלתי מתאימים לפרוטוקול החילוץ בשל אובדן פוטנציאלי של תאים במהלך הליך הכביסה.
חשוב להשתמש 5% ניטול פתרון כמו מאגר לשטוף לחילוץ מטבוליטים מתאים מתורבתים עבור ניתוח metabolomic מבוסס CE-MS, משום מאגרים מבוססי מלח, כגון PBS, להפריע ניתוח metabolomic ולהשפיע לרעה מדידה.
שניים או שלושה מאכלים יכולים להיות משולבים כמדגם אחד על ידי חילוץ בנפרד מטבוליטים מכל מנה ולאחר מכן לאגירת דגימות; עם זאת, שילוב מנות מרובות לעתים קרובות מגביר ניטול שיורית בפתרון מטבוליט שחולצו. הדבר עלול גם להפריע לניתוח metabolomic על-ידי CE-MS. לכן, מומלץ לא להשתמש בכלים או בבארות מרובים כמדגם אחד.
שיטת ניתוח metabolomic זו באמצעות CE-MS פותחה עבור מדידה מקיפה של מולקולות טעונה עם משקולות מולקולרית בין 50 ו 1000 Da; לפיכך, פרוטוקול זה ממוטב להפקת מימית, תרכובות במשקל מולקולרי נמוך. לכן, פרוטוקול זה אינו מתאים לחילוץ הידרופובי מטבוליטים כגון שומנים או קרו כגון חלבונים וחומצות גרעין. מאז יש דרישה גוברת לניתוח השומנים המקיף או lipidomics של דגימות תאים מתורבת, הפיתוח של פרוטוקול קל ואפקטיבי לחילוץ סימולטני של שני הידרופיפילית והידרופובי מטבוליטים נדרש.
הצעד הראשון של הפקת מטבוליזם-שוטף בינוני וכביסה תאים עם mannitol-יש לנהל מהר ככל האפשר כדי למזער את השינויים בפרופיל חילוף החומרים של התאים. טיפול בתאים עם מתנול לאחר כביסה עם ניטול הוא הניח החלבונים ובכך למנוע אנזימים לזרז תגובות מטבולית נוספת. עם זאת, גם לאחר הטיפול המתנול, תגובות כימיות לא-אנזימטיות-כגון תגובות נגד חמצון, כמה תהליכים דארבוקלציה, וקשרים מסוג תיול-עשויים להתרחש. ככזה, כל ריכוזים של מטבוליטים המעורבים בתגובות אלה נמדד על ידי פרוטוקול זה צריך להתפרש בזהירות. בניגוד לגנום או טראנסקריפט, המטאבאלי מורכב של מולקולות עם מגוון רחב של תכונות כימיות; מכאן, אף פרוטוקול יחיד יכול לחלץ את כל מטבוליטים ללא כל הפסד או הפרעה. למדידות מדויקות יותר של מטבוליטים מאוד תגובתי כגון, פרוטוקול שתוכנן במיוחד כדי לחלץ קבוצות מסוימות של מטבוליטים, אשר דורש הפסקות ובעלי ללעג, יש להתייעץ. הפרוטוקול המוצג כאן, עם זאת, מתאר הוצאה פשוטה ומהירה של מטבוליטים מימית מדגימות תאים מתורבת לניתוח metabolomic על ידי CE-MS. במאמר זה לא יכולנו לתאר כיצד להגדיר CE-MS בפירוט מכיוון שהמוקד של כתב היד הנוכחי הוא שונה, אולם, המתאר צעדים מפורטים להגדרת CE-MS עשוי לדרוש מאמר ייעודי נפרד.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכל חברי המרכז לקידום התעשייה האזורית שונוב על עזרתם. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרנות מחקר מפריפקטורה של יאמאגאטה ו Tsuruoka העיר, על ידי קרן הלאומי למחקר ופיתוח של המרכז לסרטן [גרנט מספר 28-A-9], ועל ידי החברה היפן לקידום המדע (JSPS) KAKENHI [גרנט מספר 17K07189] ל-HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |