Het doel van dit artikel is een protocol voor extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse, in het bijzonder, capillaire elektroforese-massaspectrometrie te beschrijven.
Metabolomic analyse is een veelbelovende omics aanpak om niet alleen de specifieke metabole regulatie in kankercellen te begrijpen in vergelijking met normale cellen, maar ook om biomarkers te identificeren voor vroegtijdig stadium kanker detectie en voorspelling van chemotherapie respons in Kankerpatiënten. Voorbereiding van uniforme monsters voor metabolomic analyse is een kritisch probleem dat nog moet worden aangepakt. Hier presenteren we een eenvoudig en betrouwbaar protocol voor de extractie van waterige metabolieten uit gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse met behulp van capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS). Waterige metabolieten van gekweekte cellen worden geanalyseerd door kweken en wassen van cellen, de behandeling van cellen met methanol, extractie van metabolieten, en het verwijderen van eiwitten en macromoleculen met spin kolommen voor CE-MS analyse. Representatieve resultaten met behulp van longkanker cel lijnen behandeld met diamide, een oxidatieve reagens, illustreren de duidelijk waarneembare metabole verschuiving van cellen onder oxidatieve stress. Dit artikel zou vooral waardevol zijn voor studenten en onderzoekers die betrokken zijn bij metabolomics onderzoek, die nieuw zijn voor het oogsten van metabolieten uit de cel lijnen voor analyse door CE-MS.
Otto Warburg merkte op dat de kankercellen de ongebruikelijke capaciteit verwerven om glucose op te nemen en het te vergisten om lactaat in aanwezigheid van adequate zuurstof te produceren-een fenomeen dat als Warburg effect wordt genoemd of aërobe glycolyse1,2. Mitochondriale Ademhalings tekorten worden gespeculeerd als onderliggende basis voor aërobe glycolyse in kankercellen3. Inderdaad, de Warburg effect is de basis voor tumor Imaging door fluorodeoxyglucose (FDG)-positron emissie tomografie (PET), die op grote schaal wordt gebruikt in de klinische praktijk4,5. Een hoge mate van aërobe glycolyse wordt beschouwd als een belangrijk kenmerk van kanker en is onlangs aangenomen als een van de bekende “kenmerken van kanker,” zoals beschreven door D. Hanahan en B. Weinberg6. Somatische mutaties in oncogenen en tumor suppressor genen — zoals HRAS/kras/nri’s, EGFR, BRAF, Myc, TP53, isocitrate dehydrogenase () enfumaraat hydratase (FH )-zijn gekoppeld aan specifieke metabole veranderingen in kankercellen, vermoedelijk een gevolg van de Warburg effect7.
Metabolomic analyse is een veelbelovende aanpak niet alleen om metabole regulatie in kankercellen te begrijpen, maar ook om vroegtijdig stadium kanker biomarkers en chemotherapie respons voorspelling te identificeren. Na behandeling van gevoelige of resistente kankercellen met antikanker verbindingen, het bijhouden van hun metabole reacties vergemakkelijkt de identificatie van metabole biomarkers om de werkzaamheid van specifieke kankertherapieën te voorspellen bij kankerpatiënten8 ,9,10,11. In dit artikel, kanker cel lijnen afgeleid van een Long adenocarcinoom met een EGFR mutatie behandeld met diamide-die oxidatieve stress veroorzaakt-werden gebruikt als modellen voor metabolomic analyse. Het voordeel van deze analytische methode met behulp van capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS) is de uitgebreide meting van de geladen metabolieten met de massa bereik m/z 50-100012,13. Het doel van dit artikel is om novicen een gedetailleerd stapsgewijze visueel protocol voor de voorbereiding van waterige metabolieten van gekweekte kankercellen en de daaropvolgende metabolomic analyse, met name door CE-MS.
Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie voor de voorbereiding van metabolieten van gekweekte kankercellen voor de CE-MS-based metabolomic analyse. Een van de meest kritieke punten in dit protocol is de juiste voorbereiding van kankercellen, omdat gemeten metaboliet concentraties zijn genormaliseerd tot het aantal levensvatbare cellen. Voor een nauwkeurige schatting van het aantal cellen is het noodzakelijk om ten minste één extra kweek schotel per experimentele groep voor te bereiden om het aantal levensvatbare cellen gelijktijdig te tellen met de extractie van metabolieten voor metabolomic analyse. Bovendien moet hetzelfde aantal cellen worden gezaaid in elk gerecht voor de herhalingen en in de schotel voor het tellen; in de toekomst zou dit worden geholpen door een snelle en stressor-vrij (bijv. trypsine-vrij) cel tellen protocol dat het mogelijk maakt dezelfde schotel te worden gebruikt voor zowel het tellen van levensvatbare cellen en het uitpakken van metabolieten. Zorg moet worden genomen tijdens de wasbeurten, zodat cellen niet los van het oppervlak van de gerechten. Ernstige chemo tests en andere experimenten die de hechting van cellen verminderen, kunnen niet geschikt zijn voor dit extractie protocol als gevolg van mogelijk verlies van cellen tijdens de wassen procedure.
Het is belangrijk om een 5% mannitol oplossing te gebruiken als de Wash buffer voor het uitpakken van metabolieten uit gekweekte cellen voor de CE-MS-based metabolomic analyse, omdat zout-gebaseerde buffers, zoals PBS, interfereren met metabolomic analyse en negatieve invloed op de meting.
Twee of drie gerechten kunnen worden gecombineerd als een enkel monster door individueel extractie van metabolieten van elk gerecht en vervolgens poolen monsters; echter, het combineren van meerdere gerechten vaak verhoogt residuele mannitol in de geëxtraheerde metaboliet oplossing. Dit kan ook interfereren met metabolomic analyse door CE-MS. Vandaar, is het raadzaam om geen gebruik maken van meerdere gerechten of putten als een enkel monster.
Deze metabolomic analysemethode met behulp van CE-MS is ontwikkeld voor een uitgebreide meting van geladen moleculen met molecuulgewichten tussen 50 en 1000 da; zo is dit protocol geoptimaliseerd voor extractie van waterige, lage molecuulgewicht verbindingen. Daarom is dit protocol niet geschikt voor het uitpakken van hydrofobe metabolieten zoals lipiden of macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren. Aangezien er een stijgende vraag naar uitgebreide lipide analyses of lipidomics van gekweekte cel steekproeven is, is de ontwikkeling van een gemakkelijk en efficiënt protocol voor gelijktijdige extractie van zowel hydrofiele als hydrofobe metabolieten nodig.
De eerste stap van de metaboliet extractie-opzuigen medium en wassen cellen met mannitol-moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om veranderingen in het metabolische Profiel van de cellen te minimaliseren. De behandeling van cellen met methanol na het wassen met mannitol wordt verondersteld om proteïnen te denatureren en daardoor enzymen te verhinderen verdere metabolische reacties te katalyseren. Echter, zelfs na methanol behandeling, niet-enzymatische chemische reacties-zoals redox reacties, sommige decarboxylatie processen, en thiol verbanden-kan plaatsvinden. Als zodanig moeten alle concentraties van metabolieten die bij deze reacties worden gemeten, met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. In tegenstelling tot het genoom of transcriptoom, bestaat de Metaboloom uit moleculen met een grote variëteit aan chemische eigenschappen; Daarom kan geen enkel protocol extract alle metabolieten zonder verlies of verstoring. Voor nauwkeurigere metingen van dergelijke zeer reactieve metabolieten moet een protocol worden geraadpleegd dat specifiek is ontworpen voor het uitpakken van bepaalde groepen metabolieten, waarvoor fractionering en derivatizations vereist zijn. Het protocol hier gepresenteerd, echter, beschrijft een eenvoudige en snelle extractie van waterige metabolieten uit gekweekte cel monsters voor metabolomic analyse door CE-MS. In deze paper konden we niet beschrijven hoe het opzetten van CE-MS in detail, omdat de focus van het huidige manuscript is anders, echter, het beschrijven van gedetailleerde stappen om het opzetten van CE-MS kan een aparte dedicated artikel vereisen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken alle leden van het Shonai Regional Industry Promotion Center voor hun hulp. Dit werk werd deels ondersteund door onderzoekfondsen van Yamagata Prefecture en Tsuruoka City, door het National Cancer Center onderzoek en ontwikkeling Fonds [Grant Number 28-A-9], en door de Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) KAKENHI [Grant Number 17K07189] aan HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |