Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

1. gün hücre kültürü 1 Not: metabolit ekstraksiyon için her örnek, orta ama tam olarak (yaklaşık 2 – 5 milyon hücre içeren) tek bir 100 mm doku kültürü çanak hazırlanmalıdır. Tahlil için gerekli yemek sayısını hesaplayın ve buna göre hazırlayın. Kültür HCC827 ve PC-9 hücreleri 5% CO2 at 37 ° c rpmi-1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile tamamlayıcı. 100 mm Kültür yemeklerinden hücre kültürü medyasını aspirate. Kalsiyum ve magnezyum olmadan 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi kullanarak her bir çanak üzerinde yıkayın hücreleri. PBS çözeltisi tamamen çanak yüzeyini kapsar, böylece yavaşça her çanak kaya. Kültür yemeklerinden yıkama tamponunu aspirate. Sıcak 0,25% Trypsin-EDTA çözeltisi 37 °C ‘ ye ve 5 mL serolojik pipet ile 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Yavaşça her yemek böylece tripsin tamamen çanak yüzeyini kapsar kaya. 37 °C ‘ de kültür yemeklerine yaklaşık 5 dakika boyunca inküye yapın. Yemek başına ön ısıtılmış tam büyüme orta 4 mL ekleyin. Birkaç kez hafifçe pipetleme tarafından orta hücreler resuspend. Her bir hücre süspansiyonunu ayrı bir 15 mL Konik Tüpe aktarın ve 800 × g ‘de Santrifüjlü 5 dk. 2 ml önceden ısıtılmış komple büyüme orta her hücre Pelet resuspend. Otomatik hücre sayacı ve 0,4% tripan mavi çözüm kullanarak hücrelerin toplam sayısını ve yüzde canlılığı belirleyin. 10 μL hücreli süspansiyon ve 10 μL 0,4% tripan mavi çözeltisi karıştırın. 10 μL örnekteki hücre sayma bölmesi kaydırağı içinde kapiller eylem yükleyin. Oda slaytı otomatik hücre sayacına yerleştirin. İletilen ışık otomatik olarak aydınlatır ve cihaz otomatik olarak hücreye odaklanır. Görüntüyü yakalamak ve sonuçları görüntülemek için Capture düğmesine basın. Gerekirse, istenilen hücre konsantrasyonunu elde etmek için daha fazla büyüme ortamı ekleyin. 100 mm hücreli kültür çanak başına yaklaşık 1 – 2.5 milyon hücre tohum.Not: CE-MS analizine göre belirlenen metabolit konsantrasyonları, uygun hücrelerin sayısına göre normalleştirilir. Hücre sayımı amacıyla, her grup için en az bir ekstra seribaşı kültür çanak hazırlamak gerekir. 37 °C ‘ de 18 saat için% 5 CO2 ‘ de kültür yemeklerini kulbe etmek. 2. Reaktiflerin hazırlanması L-metionine sülfona karaciğerde dönüştürülür ve d-Camphor-10-sülfonik asit 1000-Ultra Apure su dahil olmak üzere ticari bir iç standart çözüm seyreltilen.Not: 80 ‘ den az numune için, sadece 50 μL iç standart çözüm 1 ve 45 ml Ultra saf su için bir 50 ml hacimsel Flask, sonra çözüm kadar 50 ml Ultra saf su ile getirmek. 0,05 g/ml mannitol çözeltisi yıkama tamponu olarak ultra saf suda hazırlayın.Not: 30 ‘ dan az numune için 500 ml ‘lik Ultra Saf suyla 25 gr mannitol çözülür. 100 mm Kültür çanak başına yaklaşık 15 mL yıkama tamponu gereklidir, bu nedenle numune sayısına göre yeterli miktarda yıkama tamponu hazırlayın. 3. santrifüj filtre üniteleri ön yıkama Pipet 250 her santrifüj filtre ünitesinin filtre bardağı içine ultra saf su μL ( malzeme tablosunabakın).Not: örnek başına Iki filtre birimi gereklidir. Filtre birimlerini sıkıca kapa ve 9.100 × g ‘de 4 °c ‘ de 5 dakika santrifüjün. Her süzgecin hacmini kontrol edin — ilk kısa Spin sırasında önemli filtrat birikirse, filtre ünitesi arızalı olabilir. Bu durumda, filtre birimini atın ve bunun yerine yeni bir filtre ünitesi kullanın. Filtre ünitelerinin kapakları sıkıca kapatın ve 9.100 × g ‘de 30 dakika boyunca 4 °c ‘ de tekrar santrifüjün. Filtre bardakları herhangi bir ultra saf su kalır emin olun; Her bir toplama tüpünde süzülmüş ultra saf suyu bir pipet ile çıkarın ve atın.Not: filtreye zarar verebilmek için bir filtre bardağın içinde kalan suyu pipet ile kaldırmaya çalışmayın. Filtre bardakları toplama tüplerine değiştirin.Not: santrifüj filtre ünitelerini bir saat içinde kullanın, çünkü filtreler kurutulduktan sonra hasar görebilir. 4. gün hücre kültürü 2 100 mm Kültür yemeklerini kuluçlatıcından çıkarın.Not: önerilen hücre kültürü süresi 18 h ‘dir. Her 100 mm Kültür çanak hücre kültürü orta aspirate. Hücre katmanını rahatsız değil bakım alarak, her çanak için bileşiklerin veya ilaçların uygun konsantrasyonları içeren hücre kültürü orta 10 mL ekleyin.Not: Gösterim amacıyla, bu deneyde PBS ‘de (250 μM son konsantrasyon) çözülmüş 10 μL 250 mM diamid ekledik. 37 ° c ‘de kültür yemeklerini diamid veya PBS ‘de kontrol olarak 30 dakika süreyle kulyın. Her 100 mm Kültür çanak hücre kültürü orta aspirate. Her bir yemeğin kenarına hafifçe 2 mL% 5 mannitol çözeltisi ekleyerek hücreleri yıkayın, hücre tabakasını rahatsız etmek için değil, daha sonra biraz çanak eğim özen.Not: PBS veya tuz çözeltisi CE-MS tabanlı metabolomik analizlerle müdahale eder ve ölçüm sonuçlarını olumsuz yönde etkiler ve böylece yıkama tamponu olarak kullanılmamalıdır. Her kültür çanak yıkama tamponu aspirate, sonra hafifçe çanak başına yıkama tampon 10 mL ekleyerek ve biraz çanak eğerek hücreleri tekrar yıkayın. Tamamen her kültür çanak kenarından yıkama tampon Aspire.Not: hücreleri Aspire değil dikkat ederken, mümkün olduğunca çok yıkama tampon Aspire. Kalan mannitol CE-MS analizine engel olabilir; hücrelerin aspirasyonu hücre sayısını azaltır ve böylece veri normalleştirme bir hata kaynağı haline gelir. 5. kültürlü hücrelerden metabolitlerin çıkarılması Kültür çanak başına 99,7% metanol 800 μL ekleyin. Yavaşça tüm yüzeyi kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak kaya. Yemekleri oda sıcaklığında 30 s için bırakın. Pipetin ucunu metanol içine daldırarak ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, tabak başına seyreltilmiş iç standart çözeltinin 550 μL değerini yavaşça ekleyin. Yavaşça tüm yüzeyi kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak kaya. Yemekleri oda sıcaklığında 30 s için bırakın. 6. hücre ekstraktlarının ultrafiltrasyonu Her kültür yemeğinden çıkarılan solüsyonu ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 5 dk için 4 °C ‘ de 2.300 × g ‘de tüpleri santrifüjün. Her bir süpernatant 350 μL ‘yi örnek başına iki santrifüj filtre birimine aktarın.Not: her kültür çanak, toplam 700 μL ayıklanan çözüm iki filtre tüpleri (350 μL/tüp) aktarılır. Filtre tüplerini yaklaşık 2 saat için 9.100 × g olarak 4 °c ‘ de Santrifüjden ayırana kadar hiçbir sıvı süzgeç bardakları içinde kalmaz. Filtre bardakları çıkarın ve sıkıca toplama tüpleri kapakları kapatın. 7. örnek buharlaşma Bir santrifüj Buharlaştırıcı hazırlayın-genellikle, bu bir evaporatör oluşur, bir soğuk tuzak, ve bir vakum pompası. Toplama tüplerini santrifüj evaporatörün içine yerleştirin.Not: tüplerin kapaklarının açık olmasını bırakın. Ayıklanan numune solüsyonları, vakum koşullarında oda sıcaklığında Buharlık yapın.Not: rotasyonlar ve basınç sayısı için tipik konfigürasyonlar 1.500 rpm ve 1.000 PA, sırasıyla, ve genellikle yaklaşık alır 3 tamamen örnekleri Buharlık saat. Hiçbir sıvı toplama tüpleri içinde kalır ve sıkıca tüpler kapakları kapatın onaylayın. Toplama tüplerini Ultra düşük sıcaklıkta (− 80 °c) derin dondurucu ile metabolomik analizine kadar saklayın. 8. CE-MS tarafından metabolomic Analizi CE-MS analizinden hemen önce 50 μL ultra saf su içinde filtrat yeniden resuspend. Daha önce12,13 kapiller elektroforez sistemi ve izokrat pompa, CE-MS adaptörü ve CE-ESI-MS püskürtücü ile donatılmış uçuş zaman kitle Spektrometre sistemi kullanılarak açıklanan yöntemlerle CE-MS analizi gerçekleştirin.Not: her iki sistemde de sistem satıcılarının yazılımı tarafından kontrol edilebilir ve erimiş silika kapiller (50 μm iç çapı × 80 cm toplam uzunluğu) ile bağlanır. Enstrümanlar ve numune şişeleri ayarlayın, kapiller bir kapiller kaseti ile hazırlamak, kılıf sıvıları ve uygun Elektroforez tamponları anyon veya kstasyon analiz moduna bağlı olarak doldurmak ve sonra gerilimler uygulanır.Not: enstrümantasyon ve analitik koşullar,12,13başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yazılımı açın ve veri alma yöntemleri ve örnek bilgileri içeren bir çalışma listesi hazırlayın. Bir test çalışması başlatın ve sinyal yoğunluğu ve iç standartların tepe şekli ve diğer standart bileşiklerin tepe çözünürlüğü gibi verileri kontrol edin. Gerekirse analitik koşulların ince ayarını yapın. Örnek çözümleri 3 s için 50 mbar ‘a ve 30 kV ‘lik bir gerilime enjekte edilir.Not: CE-MS ya pozitif ya da negatif iyon modunda yürütülmüştür. M/z 50 – 1000 kitle aralığını taramak için Spektrometre ayarlayın. Kapiller voltajı 4 kV olarak ayarlandı; Azot Gazı debisi (ısıtıcı sıcaklığı 300 °C). Pozitif mod için, fragmentor, Skimmer ve OCT RFV voltaj sırasıyla 75, 50 ve 125 V olarak ayarlandı. Negatif iyon modu için fragmentor, Skimmer ve OCT RFV gerilimi sırasıyla 100, 50 ve 200 V olarak ayarlandı. Spektrum verilerini analiz edin. M/z, tepe alanı ve göç SÜRESI (MT) dahil olmak üzere en yüksek bilgileri elde etmek için otomatik entegrasyon yazılımını kullanarak kitle spektrum verilerinden zirveleri ayıklayın.Not: Yöntem, başka bir yerde14ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İzotopomerler, yaklaştırmak iyonlarına karşılık gelen sinyal zirveleri ve bilinen metabolitlerin diğer ürün iyonlarının dışlama. M/z değerlerine ve MTS ‘ye göre hmt metaboliti veritabanından gelen bilgilerle kalan zirveler ek açıklama ekleyin. Açıklama eklenmiş zirvelerin alanlarını iç standart düzeylere ve örnek başına hücre sayılarının normalleştirin. Her metabolit için hazırlanan standart eğrileri kullanarak kültürlü hücrelerde (pmol/106 hücreli) her metabolitin konsantrasyonunu değerlendir. Sonraki istatistiksel analizler ve biyolojik Yorumlar için nicelik metabolitin konsantrasyonlarını kullanın14.