A finalidade deste artigo é descrever um protocolo para a extração de Metabolites aquoso das pilhas aderentes cultivadas para a análise Metabolômica, particular, a electroforese capilar-espectrometria maciça.
A análise metabolomic é uma aproximação Ômicas prometedora para compreender não somente a regulação metabólica específica em pilhas de cancro comparadas às pilhas normais mas igualmente identificar biomarcadores para a deteção do cancro da fase inicial e a predição da resposta da quimioterapia na doentes com cancro. A preparação de amostras uniformes para a análise Metabolômica é uma edição crítica que permaneça ser endereçada. Aqui, nós apresentamos um protocolo fácil e de confiança para extrair Metabolites aquoso das pilhas aderentes cultivadas para a análise Metabolômica usando a electroforese capilar-espectrometria maciça (CE-MS). Os metabólitos aquosos de células cultivadas são analisados por culturas e células de lavagem, tratando células com metanol, extraindo metabólitos e removendo proteínas e macromoléculas com colunas de spin para a análise CE-MS. Os resultados representativos usando linhagens celulares de câncer de pulmão tratados com diamida, um reagente oxidativo, ilustram o deslocamento metabólico claramente observável das células estresse oxidativo. Este artigo seria especialmente valioso para estudantes e pesquisadores envolvidos na pesquisa de Metabolômica, que são novos para a colheita de metabólitos de linhas celulares para análise por CE-MS.
Otto Warburg observou que as células cancerosas adquirem a capacidade incomum de tomar glicose e fermentar-lo para produzir lactato na presença de oxigênio adequado — um fenômeno denominado como efeito de Warburg ou glicolólise aeróbia1,2. Os defeitos mitochondrial da respiração são especulados como a base subjacente para o glicólise aeróbio em pilhas de cancro3. De fato, o efeito de Warburg é a base para a imagem tumoral por fluorodeoxyglucose (FDG)-tomografia por emissão de pósitrons (PET), que é amplamente utilizada na prática clínica4,5. Uma alta taxa de glicólise aeróbia é considerada uma característica fundamental do câncer e foi recentemente adotada como uma das conhecidas “marcas de câncer”, como descrito por D. Hanahan e B. Weinberg6. Mutações somáticas em oncogenes e genes supressores de tumor — comoH Ras/Kras/nras, EGFR, BRAF, Myc, TP53, isocitrato desidrogenase (IDH) e fumarato hidrase (FH ) — foram ligadas a alterações metabólicas específicas nas células cancerosas, que se acredita ser resultado do efeito de Warburg7.
A análise metabolomic é uma aproximação prometedora não somente compreender a regulação metabólica em pilhas de cancro mas igualmente identificar biomarcadores do cancro do cedo-estágio e predição da resposta da quimioterapia. Após o tratamento de células cancerosas sensíveis ou resistentes com compostos anticâncer, o rastreamento de suas respostas metabólicas facilita a identificação de biomarcadores metabólicos para prever a eficácia de terapias anticâncer específicas em pacientes oncológicos8 ,9,10,11. Neste artigo, as linhagens de células cancerosas derivadas de um adenocarcinoma de pulmão com uma mutação EGFR tratada com diamida — que causa estresse oxidativo — foram utilizadas como modelos para análise metablomica. A vantagem deste método analítico usando a eletroforese capilar-espectrometria maciça (CE-MS) é sua medida detalhada de Metabolites carregado com a escala maciça m/z 50-100012,13. O objetivo deste artigo é fornecer aos noviços um protocolo Visual detalhado Stepwise para a preparação de Metabolites aquoso das pilhas cancerosas cultivadas e da análise Metabolômica subseqüente, particularmente por CE-MS.
Aqui, nós descrevemos uma metodologia extensamente acessível para preparar Metabolites das pilhas cancerosas cultivadas para a análise Metabolômica CE-MS-baseada. Um dos pontos mais críticos neste protocolo é a preparação adequada das células cancerosas, porque as concentrações de metabolito medido são normalizadas para o número de células viáveis. Para a estimativa exata do número de células, é necessário preparar pelo menos um prato de cultura adicional por grupo experimental para contar o número de células viáveis em paralelo com a extração de metabólitos para a análise metabolomica. Além disso, o mesmo número de células deve ser semeado em cada prato para as repetições e no prato para a contagem; no futuro, isso seria auxiliado por um protocolo de contagem de células rápido e livre de estresse (por exemplo, tripsina livre) que permite que o mesmo prato seja usado para a contagem de células viáveis e extração de metabólitos. Cuidados devem ser tomados durante as lavas para que as células não se desprendem da superfície dos pratos. Os testes severos da citotoxicidade e os outros experimentos que reduzem a adesão da pilha podem ser inadequados para este protocolo da extração devido à perda potencial de pilhas durante o procedimento de lavagem.
É importante usar uma solução de manitol de 5% como tampão de lavagem para extrair metabólitos de células cultivadas para análise metablomica baseada em CE-MS, pois os buffers baseados em sal, como o PBS, interferem na análise Metabolômica e afetam negativamente a medição.
Dois ou três pratos podem ser combinados como uma única amostra por extração individual de metabólitos de cada prato e, em seguida, agrupamento de amostras; no entanto, combinando vários pratos, muitas vezes aumenta o manitol residual na solução de metabolito extraído. Isto pode igualmente interferir com a análise Metabolômica por CE-MS. portanto, recomenda-se não usar vários pratos ou poços como uma única amostra.
Este método de análise Metabolômica usando o CE-MS foi desenvolvido para a medida detalhada de moléculas carregadas com pesos moleculars entre 50 e 1000 da; assim, este protocolo é otimizado para extração de compostos aquosos de baixo peso molecular. Portanto, este protocolo não é adequado para extração de metabólitos hidrofóbicos, como lipídios ou macromoléculas, como proteínas e ácidos nucleicos. Uma vez que há uma crescente demanda por análises lipídicas abrangentes ou Shotgun de amostras de células cultivadas, o desenvolvimento de um protocolo fácil e eficaz para a extração simultânea de metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos é necessário.
O primeiro passo da extração do metabolito — meio aspirante e células de lavagem com manitol — deve ser conduzido o mais rápido possível para minimizar as alterações no perfil metabólico das células. O tratamento de células com metanol após a lavagem com manitol é assumido para as proteínas de desnaturar e, assim, impedir que as enzimas catalisar outras reações metabólicas. No entanto, mesmo após o tratamento com metanol, reações químicas não enzimáticas — como reações redox, alguns processos de descarboxilação e ligações de tiol — podem ocorrer. Como tal, todas as concentrações de metabolitos envolvidos nestas reações medidas por este protocolo devem ser interpretadas com precaução. Em contraste com o genoma ou transcriptome, o metabolome consiste em moléculas com uma grande variedade de propriedades químicas; daqui, nenhum único protocolo pode extrair todos os metabolitos sem nenhuma perda ou distúrbio. Para medições mais precisas de tais metabólitos altamente reativos, um protocolo especificamente projetado para extrair certos grupos de metabólitos, que requer fraccionamento e derivatizações, deve ser consultado. O protocolo apresentado aqui, entretanto, descreve uma extração simples e rápida de Metabolites aquoso das amostras cultivadas da pilha para a análise Metabolômica por CE-MS. Neste artigo, não foi possível descrever como configurar o CE-MS em detalhes porque o foco do presente manuscrito é diferente, no entanto, descrever etapas detalhadas para configurar o CE-MS pode exigir um artigo dedicado separado.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos os membros do centro de promoção da indústria regional de Shonai por sua ajuda. Este trabalho foi apoiado em parte por fundos de pesquisa da prefeitura de Yamagata e da cidade de Tsuruoka, pelo fundo nacional de pesquisa e desenvolvimento do centro de câncer [Grant Number 28-A-9], e pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI [número de subvenção 17K07189] para HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |