Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

1. coltura cellulare al giorno 1 Nota: ogni campione per l’estrazione del metabolita deve essere preparato da un singolo piatto di coltura tissutale di 100 mm che è moderatamente ma non completamente confluente (contenente circa 2 – 5 milioni di cellule). Calcola il numero di piatti necessari per il saggio e preparali di conseguenza. Culture HCC827 e PC-9 cellule in 5% CO2 a 37 ° c in RPMI-1640 media integrata con siero bovino fetale al 10% (FBS). Aspirate i mezzi di coltura cellulare dai piatti della cultura 100 mm. Lavare le cellule su ogni piatto utilizzando 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio. Delicatamente roccia ogni piatto in modo che la soluzione PBS copre completamente la superficie del piatto. Aspirate il tampone di lavaggio dai piatti della cultura. 0,25 caldo% tripsina-EDTA soluzione a 37 ° c e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsin-EDTA con una pipetta sierologica da 5 mL. Delicatamente roccia ogni piatto in modo che la tripsina copre completamente la superficie del piatto. Incubare i piatti della cultura a 37 ° c per circa 5 min. Aggiungere 4 mL di mezzo di crescita completo pre-riscaldato per piatto. Risospendere le cellule in mezzo pipettando delicatamente più volte. Trasferire ogni sospensione di cella a un tubo conico separato da 15 mL e centrifugare a 800 × g per 5 min. Risospendere ogni pellet di cellule in 2 mL di mezzo di crescita completo pre-riscaldato. Determinare il numero totale e la redditività percentuale delle cellule utilizzando il contatore cellulare automatizzato e 0,4% trypan soluzione blu. Miscelare 10 μL di sospensione cellulare e 10 μL di soluzione 0,4% trypan blue. Caricare 10 μL di campione nello scivolo della camera di conteggio cellulare attraverso l’azione capillare. Inserire lo scivolo della camera nel contatore automatico delle celle. La luce trasmessa si illumina automaticamente e lo strumento auto si concentra sulla cella. Premere il pulsante Acquisisci per catturare l’immagine e visualizzare i risultati. Se necessario, aggiungere ulteriore mezzo di crescita per ottenere la concentrazione di cellule desiderata. Semina circa 1 – 2,5 milioni di cellule per piatto di coltura cellulare 100 mm.Nota: le concentrazioni dei metaboliti determinate dall’analisi CE-MS saranno normalizzate in base al numero di cellule vitali. Ai fini del conteggio delle cellule, è necessario preparare almeno un piatto di coltura extra seminata per ogni gruppo. Incubare i piatti della cultura in 5% CO2 a 37 ° c per 18 h. 2. preparazione dei reagenti Diluire una soluzione standard interna commerciale tra cui L-metionina sulfone e acido d-canfora-10-sulfonico 1000 volte in acqua ultrapura.Nota: per meno di 80 campioni, è sufficiente miscelare 50 μL della soluzione standard interna 1 e 45 mL di acqua ultrapura in un matraccio volumetrico da 50 mL, quindi portare la soluzione fino a 50 mL con acqua ultrapura. Preparare una soluzione di mannitolo di 0,05 g/mL in acqua ultrapura come tampone di lavaggio.Nota: per meno di 30 campioni, semplicemente sciogliere 25 g di mannitolo in 500 mL di acqua ultrapura. È necessario circa 15 mL di tampone di lavaggio per piatto di coltura da 100 mm, quindi preparare un volume sufficiente di tampone di lavaggio in base al numero di campioni. 3. unità filtranti centrifughe pre-lavaggio Pipettare 250 μL di acqua ultrapura nella Coppa del filtro di ciascuna unità filtrante centrifuga (vedere la tabella dei materiali).Nota: sono necessarie due unità filtranti per campione. Tappare saldamente le unità filtranti e centrifugare a 9.100 × g a 4 ° c per 5 min. Controllare il volume di ogni filtrato — se il filtrato significativo si è accumulato durante il primo giro breve, l’unità filtrante potrebbe essere difettosa. In questo caso, scartare l’unità filtrante e utilizzare invece una nuova unità di filtraggio. Chiudere saldamente i coperchi delle unità filtranti e centrifugare nuovamente a 9.100 × g a 4 ° c per 30 min. Assicurarsi che non rimanga acqua ultrapura in nessuna delle tazze filtranti; rimuovere l’acqua ultrapura filtrata in ogni tubo di raccolta con una pipetta e scartare.Nota: non tentare di rimuovere l’acqua residua in una tazza filtrante con una pipetta in quanto potrebbe danneggiare il filtro. Sostituire le tazze filtranti nei loro tubi di raccolta.Nota: utilizzare le unità filtranti centrifughe entro un’ora dal momento che i filtri potrebbero danneggiarsi dopo l’essiccazione. 4. coltura cellulare il giorno 2 Estrarre i piatti di coltura 100 mm dall’incubatore.Nota: la durata della coltura cellulare consigliata è 18 h. Aspirare il terreno di coltura cellulare da ogni piatto di coltura di 100 mm. Aggiungere 10 mL di mezzo di coltura cellulare che include le concentrazioni appropriate di composti o farmaci per ogni piatto, avendo cura di non disturbare lo strato cellulare.Nota: a scopo dimostrativo, abbiamo aggiunto 10 μL di 250 mM di diamido disciolto in PBS (concentrazione finale di 250 μM) in questo esperimento. Incubare i piatti della cultura a 37 ° c per 30 minuti in presenza di diamido o PBS come controllo. Aspirare il terreno di coltura cellulare da ogni piatto di coltura di 100 mm. Lavare le cellule aggiungendo delicatamente 2 mL di soluzione di mannitolo al 5% al bordo di ogni piatto, avendo cura di non disturbare lo strato cellulare, quindi inclinare leggermente il piatto.Nota: la soluzione salina o PBS interferisce con l’analisi metabolomica basata su CE-MS e influisce negativamente sui risultati delle misurazioni e pertanto non deve essere utilizzata come tampone di lavaggio. Aspirare il tampone di lavaggio da ogni piatto di coltura, quindi lavare nuovamente le cellule aggiungendo delicatamente 10 mL di tampone di lavaggio per piatto e inclinando leggermente il piatto. Aspirare completamente il tampone di lavaggio dal bordo di ogni piatto di coltura.Nota: aspirare il più possibile il tampone di lavaggio, prestando attenzione a non aspirare le cellule. Il mannitolo residuo può interferire con l’analisi CE-MS; l’aspirazione delle cellule diminuirà il numero di cellule e diventerà quindi una fonte di errore nella normalizzazione dei dati. 5. estrazione di metaboliti da cellule coltivate Aggiungere 800 μL di 99,7% di metanolo per ogni piatto di coltura. Delicatamente roccia ogni piatto di cultura avanti e indietro per coprire tutta la sua superficie. Lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 s. Aggiungere lentamente 550 μL di soluzione standard interna diluita per piatto immergendo la punta della pipetta nel metanolo e pipettando delicatamente su e giù più volte. Delicatamente roccia ogni piatto di cultura avanti e indietro per coprire tutta la sua superficie. Lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 s. 6. ultrafiltrazione di estratti cellulari Trasferire la soluzione estratta da ogni piatto di coltura a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL separata. Centrifugare i tubi a 2.300 × g a 4 ° c per 5 min. Trasferire 350 μL di ogni supernatante in due unità filtranti centrifughe per campione.Nota: da ogni piatto di coltura, un totale di 700 μL di soluzione estratta viene trasferito in due provette filtranti (350 μL/tubo). Centrifugare i tubi filtranti a 9.100 × g a 4 ° c per circa 2 h fino a quando non rimane liquido nelle tazze filtranti. Rimuovere le tazze filtranti e chiudere ermeticamente i coperchi dei tubi di raccolta. 7. evaporazione del campione Preparare un evaporatore centrifugo — tipicamente, questo è costituito da un evaporatore, una trappola fredda, e una pompa per vuoto. Collocare i tubi di raccolta nell’evaporatore centrifugo.Nota: lasciare aperti i coperchi dei tubi. Evaporare le soluzioni di campionamento estratte in condizioni di vuoto a temperatura ambiente.Nota: le configurazioni tipiche per il numero di rotazioni e pressione sono 1.500 rpm e 1.000 PA, rispettivamente, e di solito ci vogliono circa 3 h per evaporare completamente i campioni. Verificare che nessun liquido rimanga in nessuno dei tubi di raccolta e chiudere saldamente i coperchi dei tubi. Conservare i tubi di raccolta in un congelatore profondo a bassissima temperatura (− 80 ° c) fino all’analisi metabolomica. 8. analisi metabolomica di CE-MS Risospendere il filtrato in 50 μL di acqua ultrapura immediatamente prima dell’analisi CE-MS. Eseguire l’analisi CE-MS con metodi descritti in precedenza12,13 utilizzando il sistema di elettroforesi capillare e il sistema di spettrometro di massa a tempo di volo dotato di una pompa isocratica, un adattatore CE-MS e uno spruzzatore CE-ESI-MS.Nota: entrambi i sistemi possono essere controllati dal software dei venditori di sistema e sono collegati da un capillare di silice fusa (50 μm di diametro interno × 80 cm di lunghezza totale). Impostare gli strumenti e le fiale di campionamento, preparare il capillare con una cassetta capillare, ricostituire i liquidi della guaina e i tamponi di elettroforesi appropriati in base alla modalità di analisi anionica o cationico, quindi applicare tensioni.Nota: la strumentazione e le condizioni analitiche sono descritte in dettaglio altrove12,13. Aprire il software e preparare una lista di lavoro contenente i metodi di acquisizione dati e le informazioni di esempio. Avviare una corsa di prova e controllare i dati come l’intensità del segnale e la forma di picco degli standard interni e la risoluzione di picco di altri composti standard. Se necessario, regolare le condizioni analitiche. Iniettare le soluzioni campione a 50 mbar per 3 s e una tensione di 30 kV.Nota: CE-MS è stato condotto sia in modalità ioni positive che negative. Impostare lo spettrometro per scansionare l’intervallo di massa m/z 50 – 1000. La tensione capillare è stata fissata a 4 kV; la portata del gas di azoto (temperatura del riscaldatore 300 ° c). Per la modalità positiva, il fragmentor, skimmer e OCT RFV tensione sono stati impostati a 75, 50 e 125 V, rispettivamente. Per la modalità a ioni negativi, il fragmentor, skimmer, e OCT RFV tensione è stato impostato a 100, 50 e 200 V, rispettivamente. Analizzare i dati dello spettro. Estrai i picchi dai dati spettrali di massa utilizzando il software di integrazione automatica al fine di ottenere informazioni di picco tra cui m/z, area di picco e tempo di migrazione (mt).Nota: il metodo è descritto in dettaglio altrove14. Escludere i picchi di segnale corrispondenti a isotopomeri, ioni addotti e altri ioni di prodotti di metaboliti conosciuti. Annotare i picchi rimanenti con informazioni dal database del metabolita HMT in base ai valori m/z e MTS. Normalizza le aree dei picchi annotati ai livelli standard interni e al numero di celle per campione. Valutare la concentrazione di ciascun metabolita nelle cellule coltivate (pmol/106 cellule) utilizzando le curve standard preparate per ciascun metabolita. Utilizzare le concentrazioni dei metaboliti quantificati per le successive analisi statistiche e le interpretazioni biologiche14.