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Developmental Biology

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/59459
, , ,
1Drosophila Genomics Resource Center, Department of Biology,Indiana University Bloomington

Summary

Lignées de cellules de drosophile sont importants réactifs pour la recherche fondamentale et recherche biomédicale. Cet article fournit des protocoles pour la décongélation, repiquage et la cryoconservation des lignées de cellules Drosophila couramment utilisées pour aider les chercheurs à intégrer l’emploi de ces réactifs dans leurs recherches.

Abstract

On compte actuellement plus de 160 lignées cellulaires Drosophila distinctes, distribuées par le centre de ressources pour le génomique Drosophila (DGRC). Avec le génie du génome, le nombre de nouvelles lignées cellulaires devrait passer. La DGRC a pour but de familiariser les chercheurs avec l’aide de lignées cellulaires de drosophile comme un outil expérimental pour compléter et orientent le calendrier de leur recherche. Procédures permettant de travailler avec une variété de lignées cellulaires drosophile ayant des caractéristiques distinctes sont prévues, y compris des protocoles pour la décongélation, cultivant et cryoconservation des lignées cellulaires. Ce qui est important, cette publication montre les méthodes conseillées pour travailler avec des lignées de cellules de drosophile pour minimiser les risques de contaminations de microorganismes adventices ou d’autres lignées cellulaires. Les chercheurs qui sont familiariser avec ces procédures seront en mesure de se plonger dans les nombreuses applications qui utilisent des cellules de drosophile cultivés dont la biochimie, la biologie cellulaire et la génomique fonctionnelle.

Introduction

L’utilisation de la drosophile cultivé des cellules compléments in vivo voler analyse génétique et constitue un outil d’enquête primaire pour répondre aux nombreuses questions biologiques fondamentales1,2,3. Lignées cellulaires Drosophila offrent unique population homogène de cellules dérivées des sources de tissus différents avec des antécédents génétiques distinctes. Lignées cellulaires ne conviennent pas pour de nombreuses applications, y compris l’expression des gènes transgéniques, génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique, écrans de haut débit RNA interférence (Arni), biologie cellulaire et la microscopie. Ce qui est important, l’utilisation de culture de cellules de drosophile facilite la caractérisation des réponses temporelles immédiates à un stimulus connu. En outre, culture de cellules de drosophile se prête au génome CRISPR-Cas9 édition, ce qui en fait relativement facile de créer de nouvelles lignées de cellules avec génome spécifique modifications4,5,6, 7.

La drosophile génomique Resource Center (DGRC) sert de centre référentiel et de la distribution pour les lignées cellulaires de drosophile . L’un des objectifs de la DGRC est d’aider les membres de la communauté de recherche en utilisant les ressources de la culture de cellule Drosophila . Cet article présente les protocoles de base pour la manipulation des lignées de cellules de drosophile . Il complète les ressources existantes pour aider les chercheurs à devenir à l’aise avec la manipulation des cultures de cellules de drosophile et atteindre un niveau d’autonomie dans leurs expériences1,2,8,9 ,,10.

Les lignées de cellules de drosophile plus couramment utilisées sont : Schneider les lignes11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake disque imaginal et système nerveux central (SNC) lignes13,14, lignes de disques imaginaux de laboratoire Milner 15, les cellules ovariennes adultes lignes16,17et le Ras lignes18 (tableau 1). Les lignes de Schneider et Kc167 sont des lignées tout usage générales pour une utilisation en biochimie, l’expression des gènes transgéniques recombinant et des écrans de génétiques inverses. Les lignes de laboratoire (ML) de Mitsubishi/Miyake proviennent des disques imaginaux larvaires ou du système nerveux central (SNC) et ils ont été utiles pour les études liées à neurosécrétions, régulation de la transcription et ARN. Les lignes de disque Milner (CME) ont été importants pour l’étude de la transduction du signal. Les lignées de cellules fGS/OSS dérivées de mutants ovaires adultes restent réactifs importants d’étudier l’impact de non-codage petite biologie des ARN dans des cellules germinales entretien et différenciation17,19. Enfin, les lignes de Ras sont uniques car ce sont des lignées de cellules provenant d’embryons de façon ectopique exprimant l’oncogène Ras. Ils ont la signature de transcriptional des cellules précurseurs musculaires et exprime piRNA active machines20. Récent examen articles et chapitres de livres couvrent les applications de ces lignées de cellules populaire avec plus de détails2,3,9.

Toutes ces lignées cellulaires peuvent être repiquées et congelées. Il y a des exigences différentes légères mais importants pour chaque lignée cellulaire est maintenue et préparée pour la cryoconservation. Par exemple, des lignées distinctes nécessitent différents médias et suppléments (tableau 1). Les lignes varient également dans les propriétés de la surface d’adhérence, morphologies (Figure 1 et Figure 2), le génotype et le temps de doublement (tableau 2). Nous présentons des protocoles de base et mettre en évidence les différences uniques pour gérer les diverses lignées de cellules de Drosophila largement utilisées.

Protocol

1. dégel et la relance des lignées de cellules congelées Drosophila Stériliser le capot en frottant la surface avec l’éthanol à 70 %. Diluer 5 mL de milieu approprié (tableau 1) dans un 25 cm2 T-fiole (T-25). Retirez le cryovial/ampoule de liquide N2 ou de la neige carbonique. Essuyer le cryovial avec 70 % d’éthanol, soigneusement desserrer et desceller l’ampoule. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirer 1 mL de médias de la température ambiante (RT) de la fiole de T-25. Ajouter lentement les médias dans la cryovial et mélanger doucement pour dégeler les cellules congelées, veiller à ce que la suspension cellulaire ne deborde pas. Transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire décongelés de l’ampoule dans le ballon de T-25. Répétez l’opération pour s’assurer que la suspension cellulaire a été complètement transférée. Placer la fiole dans une étuve à 25 ° C, permettant aux cellules de s’installer et se conformer pendant au moins 2 h. Examinez les cellules au microscope pour s’assurer que la plupart des cellules sont sont installés sur la surface en pleine croissance. Délicatement enlever les anciens médias et le remplacer par 5 mL de supports neufs. Retourner le flacon dans l’incubateur. Le lendemain, retirez les anciens médias doucement et remplacer par 5 mL de supports neufs. Remettez la culture dans l’incubateur. 2. dégel et la relance des lignées de cellules congelées Drosophila (Alternative) Sous une hotte stérile, dégelez les cellules en resuspendant le culot congelé avec 1 mL de médias de RT. Transférer tous la suspension cellulaire décongelés dans un tube conique de 15 mL. Les cellules de granule par centrifugation à 1 000 g pendant 5 min. jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL de supports neufs. Transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire dans une fiole de T-25 et incuber la culture à 25 ° C. 1 à 2 h plus tard, examiner les cellules au microscope pour s’assurer que la plupart des cellules sont sont installés sur la surface en pleine croissance. Le jour suivant, remplacer les anciens médias avec 5 mL de supports neufs et remettez la culture dans l’incubateur. 3. repiquage des cellules semi adhérentes cultivées en plaques de Culture de 100 mm Stérilisez la hotte en l’essuyant avec l’éthanol à 70 %. Apporter le matériel stérile pour un repiquage dans la hotte, y compris les supports bouteilles, pipettes, aide de la pipette et plaques de culture. Étudier la morphologie et la confluence de la culture sous un microscope. Recherchez des signes clairs de contaminations microorganismal dans la culture. Déterminer si les cellules sont prêtes à être repiquées, basée sur les caractéristiques de la culture : cell de densité et doubler le temps, y compris la dernière fois qu’ils ont été repiqués. Si la culture apparaît très anastomosé (Figure 1), déterminer la densité cellulaire. Dans la hotte stérile, déloger les cellules de la surface croissante de pipetage jusqu’à 10 mL du milieu de la plaque et il distribuer sur les cellules. Répétez plusieurs fois, assurer pour ne pas créer de mousse, jusqu’à ce que la surface croissante devient claire. Déterminer la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de particules automatique (section 5, Figure 3). Repiquer les cellules si la densité cellulaire est entre 5 x 10,6 et 1 x 107 cellules/mL.Remarque : Ne pas sous-culture Drosophila lignées cellulaires à une densité inférieure à 1 x 106 cellules/mL. Diluer la suspension cellulaire en conséquence à l’aide d’un milieu approprié à une concentration finale de semis d’au moins 1 x 106 cellules/mL. De passage et d’entretien courants, ajouter un volume approprié de suspension cellulaire à un volume prédéterminé du support, une nouvelle plaque de culture pour atteindre la densité des cellules semis désirée. Pour amplifier une culture, transférer tous la suspension cellulaire dans un gros ballon. Diluer la suspension cellulaire à la densité de la cellule souhaitée avec un volume approprié du milieu. Distribuer des volumes égaux de la suspension cellulaire dilué de nouvelles plaques. Cette méthode minimise les variations de densité des cellules entre les plaques. Couvrir et étiqueter les plaques avec les initiales de l’opérateur, date, coefficient de fractionnement, la densité cellulaire semis, identificateur de ligne cellulaire, médias, nombre de passage et tout ajout de médias tels que les antibiotiques. Placer les plaques dans un récipient en plastique et remettez la boîte dans l’incubateur.Remarque : tableau 3 répertorie les récipients de culture couramment utilisés pour la culture de lignées cellulaires de drosophile et les volumes de travail associés. 4. délogeant les cellules adhérentes cultivées en plaques de Culture de 100 mm Transférer tout le milieu de la plaque à un nouveau flacon stérile. Sauver le milieu. Rincer les cellules en ajoutant lentement 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à la plaque. Agiter doucement pour s’assurer que la solution de trypsine couvre la surface entière de la croissance. Jeter la solution de trypsine. Doucement ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à la plaque. Incuber les plaques à 25 ° C entre 3−10 min alors que la surveillance des signes visibles de la couche de cellules détacher et en faisant glisser hors de la surface croissante. Ajouter 9 mL de milieu enregistré sur la plaque pour arrêter l’activité de la trypsine. Mélanger la suspension cellulaire pour dissocier les amas de cellules. Une fois que toutes les cellules ont été délogés, la surface croissante sera claire.Remarque : L’utilisation d’enzymes digestives telles que le sida la trypsine dans le passage des lignées de cellules fortement adhérentes. La trypsine est un mélange de protéases souvent dérivés de pancréas de porc et est commercialement disponible en différentes qualités de pureté. 5. manuel cellule comptage en utilisant la cellule Neubauer comptage Slide Préparer l’hémocytomètre lame et lamelle en frottant la surface avec de l’alcool 70 %. Mélanger la suspension cellulaire et verser 15 µL de la suspension cellulaire dans le bord rainuré de la hémocytomètre (Figure 3 a) pour remplir la première chambre de la hémocytomètre. Remplissez la deuxième chambre de la hémocytomètre. La suspension cellulaire sera attirée dans la chambre de comptage par capillarité. À l’aide d’un 10 x objectif de microscope, compter les cellules dans la zone2 de 1 mm au milieu de la grille liée par les lignes parallèles (Figure 3,D). Pour éviter une double comptabilisation, compter les cellules qui superposeront haut et gauche de limites, mais pas les cellules qui traversent les limites droite et en bas des 200 µm2 places. Compter entre 100−200 cellules. Répétez le décompte à la seconde chambre. Calculer la moyenne des deux chefs d’accusation et de déterminer la densité des cellules selon la formule suivante : (cellules/mL) la densité de cellules = nombre moyen de cellules (n1 + n22) x 104.Remarque : La viabilité cellulaire est exprimée sous forme de pourcentage de cellules viables sur cellules totales. Pour déterminer la viabilité cellulaire, mélanger la suspension cellulaire avec un volume égal de bleu trypan (0,4 %) solution avant le comptage manuel ou automatique des cellules. Des cellules vivantes prendra pas le colorant, tandis que les cellules mortes seront être colorées en bleus. 6. cryoconservation de lignées cellulaires de drosophile Vérifiez la culture pour la morphologie en bonne santé, la croissance et l’absence de contamination. Récolter les cultures de la mi à la phase de croissance de la fin-log (étape 3.3, ou l’article 4). De nombreuses lignées cellulaires de drosophile , c’est environ entre 4 x 106 cellules/mL à 8 x 106 cellules/mL. Transférer la suspension de toute cellule dans un tube conique 15 mL ou 50 mL. Recueillir les cellules par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans un volume de congélation moyen (tableau 4) qui se traduira par une densité finale d’au moins 4 x 107 cellules/mL. Ajouter goutte à goutte la quantité appropriée de la substances cryoprotectrices diméthyl sulfoxyde (DMSO) dans la suspension cellulaire telle que la concentration finale de DMSO est de 10 %. Mélanger délicatement la suspension cellulaire. Soigneusement diluer 0,5 mL de la suspension cellulaire dans des parties aliquotes de la cryovials préalablement étiquetées (~ 2 x 107 cellules/flacon). Placer les ampoules dans un gel contenant rempli avec de l’isopropanol (Figure 4 a). Transférer le conteneur congélation dans un congélateur-80 ° C durant la nuit pour permettre à la température de la cryovials à baisser lentement (-1 ° C/min) à la température du congélateur. Retirez le cryovials congelés et attacher rapidement à Cannes (Figure 4 b). Insérer les champs de roseaux contenant cryovials dans une boîte métallique (Figure 4). Sinon, placer cryovials congelé à l’intérieur d’une boîte de congélation refroidissement préalable (Figure 4). Conserver congelé cryovials dans la phase liquide des congélateurs de2 N (Figure 4E,F).Remarque : Lorsque vous utilisez le gel médias contenant DMSO, un retard de plus de 30 min à ta n’est pas préjudiciable aux cellules.

Representative Results

Il est important de décongeler rapidement les cellules congelées de drosophile et leur culture à une densité cellulaire qui ramène la culture dans la phase de croissance. Si les procédures de cryopréservation et dégel sont respectées, la densité cellulaire dans le flacon de T-25 est au moins égale à 4 x 106 cellules/mL. Une à deux heures après décongélation, la plupart des lignées de cellules Drosophila commencera à fixent à la surface en pleine croissance. Dans les circonstances dans lesquelles la plupart des cellules n’avez connecté sur l’aire de croissance dans les deux heures après décongélation, il est recommandé d’incuber les cellules pendant la nuit avant de changer les médias. Le repiquage vise à maintenir les cellules en bonne santée journal-phase exponentielle de la courbe de croissance. Les critères pour un repiquage dépendent de l’absence visible de contamination microorganismal, densité cellulaire et la nécessité d’établir un calendrier d’entretien régulier. Il faut d’abord évaluer l’intégrité des cellules et déterminer l’absence de tout contaminant adventice avant congélation. La plupart des contaminants bactériens et fongiques sont faciles à détecter par simple inspection visuelle. Cultures contaminées peuvent être identifiés par une augmentation de la turbidité médias. Sous le microscope, les contaminants peuvent apparaître comme bactériennes tiges, coques, bourgeonnement des cellules de levure ou hyphes fongiques de type chaîne. Autres sources de contamination, telles que le mycoplasme non-cytopathiques ne peuvent pas être détectés visuellement et peuvent être testés régulièrement par des analyses PCR21. La confluence d’une lignée cellulaire peut être déterminée visuellement (Figure 1). Des lignées de cellules en croissance rapide atteignent la confluence tôt et doivent être repiquées régulièrement. Ces lignes sont repiqués jusqu’à deux fois par semaine. En revanche, les cellules en croissance lentes sont repiquées au moins une fois toutes les deux semaines ou plus. Cependant, les cellules ont besoin d’être nourri les supports neufs chaque semaine. Il s’agit d’empêcher l’épuisement de médias et de diluer les produits de déchets métaboliques des cellules. Lignées cellulaires dérivé variant tissus sources diffèrent par leur morphologie (Figure 2), propriétés d’adhérence, spécifications des supports (tableau 1) et de doubler le temps (tableau 2). Tableau 5, tableau 6, tableau 7et tableau 8 listent les recettes pour les différents milieux de culture cellulaire drosophile . Compter les cellules assure une densité de semis précise et une routine prévisible pour un repiquage. Pour les expériences quantitatives, comptage de cellules est essentiel. Les cellules sont comptées soit en utilisant un hémocytomètre (Figure 3 a) ou un compteur de particules automatisés (Figure 3 b). Si vous utilisez un compteur automatisé, suivez les instructions du fabricant. Comptage des cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre est économique et facile. Le nombre de cellules dans les grilles de Neubauer moyens est compté et la densité cellulaire est calculée ; Par exemple, n = 214 cellules, ayant pour résultat une densité cellulaire de 2,14 x 106 cellules/mL (Figure 3D). Suspension de cellules de deux plaques de 100 mm, chacune contenant 10 mL de suspension cellulaire à 4 x 106 cellules/mL sont collectés et resuspendues dans 2 mL de gel de médias pour atteindre une densité de 4 x 107 cellules/mL. Chaque cryovial congelé avec 0,5 mL de suspension cellulaire contient 2 x 107 cellules. Cela se traduira par une culture avec 4 x 106 cellules/mL lorsque dégelé selon l’article 1 du protocole. Figure 1 : Images représentatives de trois distinctes Drosophila lignées à différentes densités de confluence et cellulaire cellulaires. (A) S2-DGRC culture à 1 x 106 cellules/mL. (A’) Culture S2-CRMD à 4,5 x 106 cellules/mL. ML-BG2-c2 (B) la culture à 2 x 106 cellules/mL. (B’) ML-BG2-c2 culture à 8 x 106 cellules/mL dans lequel les cellules sont pieux et agrégation comme foyers. (C), OSS culture à 1 x 106 cellules/mL. (C’) Culture de OSS à 4 x 106 cellules/mL. Les cellules en suspension ne sont pas capturées sur le même plan focal. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.  Figure 2 : Des images représentatives des huit différentes lignées cellulaires Drosophila . (A) ronde dérivées d’embryons S2-CRMD. (B) ronde dérivées d’embryons Kc167. (C) rond dérivé de CNS larvaire ML-BG2-c2. (D) ronde larves fusiformes ML-BG3-c2. (E) mec L1, une lignée de cellules provenant de disques imaginaux de l’étape larvaire, est plus petit et a une morphologie ronde/fusiforme. OSS (F), une lignée de cellules provenant des ovaires adultes, affiche de morphologie fusiforme. (G), à la lignée de cellules fusiformes RasV12 exprimant activé Ras. (H) RasV12; wtsArni (WRR1), une lignée de cellules exprimant Ras activé et l’ARN double brin ciblant les tumor suppressor verrues (wts), affiche des caractéristiques épithéliales. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Densité cellulaire peut être comptée manuellement à l’aide d’un hémocytomètre ou automatiquement à l’aide d’un compteur de particules automatisés. (A) A hémocytomètre avec deux chambres. (B) un compteur de cellules automatisé affichant la sortie d’un nombre de cellules. (C) le comptage de cellules de Neubauer amélioré grille examinée sous un objectif 10 x. Compter les cellules liées par la grille centrale de 0,1 mm3 (place de pointillés rouge). (D) la grille centrale sur l’hémocytomètre rempli de cellules de comptage. Echelle = 1 mm (C) ; 0,2 mm (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Équipement pour la cryoconservation. (A) A congélation conteneur magasins ampules en position verticale pour la congélation lente. (B) une canne métallique pour maintenir les ampoules congelées. (C), un récipient pour la tenue de Cannes. (D), une boîte de congélation en plastique (cryobox). (E), une boîte métallique détenant plusieurs Cannes insérés dans une cuve de stockage liquide N2 . (F), un liquide N2 réservoir de stockage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Cellule souche Médias Adhérence Trypsine Lignes de Schneider M3 + BPYE + 10 % de sérum foetal de veau (FCS), pH 6,6 Semi-adhérent non (S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11 De Schneider médias+ + 10 % FCS KC lines (Kc167, Kc7E10),21, 22 M3 + BPYE + 5 % FCS, pH 6,6 Semi-adhérent non Hyclone-CCM3, pH 6.2 Disque imaginal et CNS (ML-lignes)13,14 M3 + BPYE + 10 % FCS, pH 6,6 Semi-adhérent non 10 µg/mL d’insuline Milner disque imaginal lignes (lignes de CME)15 M3 + 2 % FCS Semi-adhérent non 5 µg/mL d’insuline 2,5 % d’extrait de mouche fGS/OSS16 M3 + 10 % FCS, pH 6,8 ADHERENT * 10 µg/mL d’insuline 1 mg/mL C5H8KNO4   0,5 mg/mL KHCO3  glutathion de 0,6 mg/mL 10 % d’extrait de mouche RasV12 lignes18 M3 + BPYE + 10 % FCS, pH 6,6 ADHERENT Oui Tableau 1 : Exigences de diverses propriétés et médias Drosophila lignées cellulaires. Différents isolats de semi adhérente Schneider lignes dont S2R +, S2-Drosophila Arni Screening Center (DRSC), S2-Drosophila génomique Resource Center (DGRC) et Sg4 sont des lignées de cellules couramment utilisés qui prolifèrent de façon robuste lorsqu’il est cultivé dans les médias de M3 + Extrait de levure de Bactopetone (BPYE) additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS). Alternativement, médias de Schneider (pH de 6,7 à 6,8) est souvent utilisé à la place de la M3 + BPYE. Les lignes Kc prolifèrent en soit M3 + BPYE (5 % FCS) ou sans sérum CCM3 médias. Le disque imaginal de ML et du système nerveux central (SNC) lignes exigent supplémentation d’insuline pour la prolifération. Les lignes de disque imaginal Milner exigent l’insuline et mouche extract supplementation. Lignées de cellules adhérentes fGS/OSS exigent l’insuline, une concentration plus élevée de mouche extrait comme glutathion pour la croissance. Lignes de RasV12 adhérentes se développent bien en M3 + BPYE (10 % FCS). La trypsine est utilisée pour déloger les lignées de cellules adhérentes de la surface de croissance. Lignée cellulaire (Stock #) Génotype Temps (h) * Source de tissu S2R + (150) OreR 39 Embryons fin S2-DGRC (6) OreR 23 Embryons fin S2-DRSC (181) OreR 46 Embryons fin Kc167 (1) e/se 22 6−12 embryons h ML-BG2-c2 (53) y v f mal 48 3rd stade larvaire CNS ML-BG3-c2 (68) y v f mal 104 3rd stade larvaire CNS ML-DmD8 (92) y v f mal 66 3 disque d’aile larves de staderd CME W1 Cl.8+ (151) OreR 46 3 disque d’aile larves de staderd CME L1 (156) OreR 47 3 disque de jambe larves de staderd OSS (190) bamD86 45 Ovaires mutante adulte bam RasV12 lignes SAMU-GFP ; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 41−65 Embryon Tableau 2 : Génotype, doubler le temps et les sources de tissus de largement utilisé Drosophila lignées cellulaires. Le génotype de tissu, la source et la population doubler le temps de lignées cellulaires couramment utilisés sont présentés. Temps de doublement est basé sur la croissance dans les médias recommandées à 25 ° C. Récipient de culture Volume des médias (mL) 12,5 cm2 T-flacon 2.5 25 cm2 T-flacon 5 75 cm2 T-flacon 15 plaque de 35 mm 1 plat 60 mm 4 plaque de 100 mm 10 plaque 384 puits * 0,04/puits plaque 96 puits * 0,1/puits plaque de 48 puits * 0,3/puits plaque 24 puits * 0,5/puits plaque de 12 puits 1.0/puits plaque 6 puits 2.0/puits Tableau 3 : Culture des navires et les volumes de médias recommandée. Les récipients de culture de différentes tailles sont disponibles pour la culture des cellules de drosophile . Les volumes de support approprié (mL) sont recommandés pour chaque navire. Sceller les plaques multipuits contenant moins de 0,5 mL de suspension cellulaire avec film de paraffine pour réduire la perte due à l’évaporation de médias. Volume M3 + BPYE, pH 6,6 70 mL Chaleur inactivé FCS 20 mL DMSO filtré stérile * 10 mL Tableau 4 : recette pour la préparation de 100 mL de milieu de congélation (M3 + BPYE, FCS de 20 %, 10 % DMSO). Préparer les médias gel selon les besoins et éviter de stocker des médias gel contenant du DMSO pendant une période prolongée. M3 + support BPYE Montant Boucliers et a chanté de M323 1 bouteille KHCO3 0,5 g Extrait de levure Select 1,0 g Bactopeptone 2,5 g Eau purifiée stérile 1000 mL Tableau 5 : Recette pour préparer 1 L de la M3 + BPYE milieu de culture tissulaire. Ajuster le pH à 6,6. Stériliser en passant le milieu à travers un filtre de 0,22 µm. Milieu de base M3 sur lignée cellulaire fGS/OSS Montant Boucliers et a chanté M3 1 bouteille KHCO3 0,5 g C5H8KNO4   1,0 g Eau purifiée stérile 1 000 mL Tableau 6 : Recette pour 1 L de milieu de base fGS/OSS M3. Ajuster le pH à 6,8. Stériliser en passant le milieu à travers un filtre de 0,22 µm. Hyclone-CCM3 Montant CCM3 poudre 28,6 g NaHCO3 0,35 g 10 N NaOH 2,5 mL CaCl2 0,5 g Eau purifiée stérile 1 000 mL Tableau 7 : Recette pour 1 L de milieu de culture de tissu Hyclone-CCM3. Ajuster le pH à 6,2. Stériliser en passant le milieu à travers un filtre de 0,22 µm. M3 + BPYE + 10 % FCS Disque de Miyake et CNS lignes moyennes Milieu de lignes pour le disque Milner milieu complet fGS/OSS M3 + BPYE, pH 6,6 90 mL 90 mL – – Chaleur inactivé FCS * 10 mL 10 mL 2 mL 10 mL Insuline (10 mg/mL) – 100 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Extrait de la mouche – – 2,5 mL 10 mL Glutathion (60 mg/mL) – – 1 mL M3, pH 6,6 – – 97,5 mL – fGS/OSS M3, pH 6,8 – – 79 mL Tableau 8 : Recette pour la préparation de 100 mL de diverses communes Drosophila milieux de culture cellulaire. Incuber les FCS à 56 ° C pendant 1 h et agiter toutes les cinq minutes pour chaleur-inactiver les protéines du complément.

Discussion

Les cultures de cellules de drosophile sont des réactifs primaires pour les écrans de haut débit basés sur les cellules. Leur utilisation complète également la recherche en génétique in vivo en fournissant une population homogène de cellules appropriés pour la biochimie, rapid testing de constructions transgéniques avant l’injection dans les mouches, biologie cellulaire, microscopie et, plus récemment, génétique des cellules somatiques manipulations du génome modifiant1,2,3,8,9,10.

La viabilité et la récupération de cellules congelées de drosophile est sensible aux fluctuations radicales même à basse température. La DGRC stocke des lignées de cellules congelées dans la phase liquide de N2 (-196 ° C) et les transporte dans la glace sèche (-78,50 ° C). Ampoules congelées qui ont été transportés dans la glace sèche ne devraient pas être transférées en liquide N2 ou un congélateur-80 ° C pour le stockage. Au lieu de cela, les cellules congelées devraient être décongelés, redéfinies à une densité cellulaire élevée dès que possible à l’arrivée (protocole 1 de l’article) et cultivées pour leur destination (protocole, article 3). Si les lignées cellulaires ne sont pas immédiatement utilisées pour des expériences, la cellule lignes devraient être cryoconservés (article 6 du protocole) jusqu’à ce qu’ils sont prêts à l’emploi.

Certaines lignées de cellules, telles que les lignes ML-BG2-c2 et Ras ont besoin de plusieurs jours pour surmonter les effets d’être relancé par l’état cryopréservé. Une quantité importante de débris cellulaires accompagne ces lignées cellulaires, les premiers jours après décongélation. Laissé intact, les cellules vont récupérer et prolifèrent. Plusieurs lignées de cellules de drosophile à la DGRC ont été adaptées en M3 selon médias22. Pour les lignées de cellules qui sont lentes à se remettre des effets de la fonte, l’utilisation de milieux conditionnés peut être utile. Milieux conditionnés susceptible de contenir des facteurs de croissance sécrétés par les cellules dans les médias susceptibles d’encourager la récupération et la prolifération des cellules après décongélation.

Lignées cellulaires suivent généralement une courbe de croissance stéréotypées consistant en une phase de latence, la phase exponentielle de croissance, phase de plateau et une phase de détérioration. Plusieurs lignées de cellules de drosophile prolifèrent dans la phase logarithmique de croissance quand ils sont cultivés à une densité de 1 x 106 à 1 x 107 cellules/mL à 25 ° C. Il est essentiel que les lignées cellulaires sont repiquées tels qu’ils sont toujours en phase de croissance exponentielle.

La confluence d’une culture, exprimée en pourcentage, décrit la surface de croissance qui est couvert par les cellules. Confluence des cellules sur une lignée cellulaire dépend de sa forme des cellules et la taille. Lignées cellulaires distincts ont des morphologies différentes et des propriétés d’adhérence. Ainsi, différentes lignées cellulaires à environ semblable confluence peuvent avoir la densité des cellules très distinctes (Figure 1). Confluence de la culture peut ne pas être un indicateur idéal pour le passage des cultures de cellules de drosophile parce que les lignées de cellules de drosophile continuent à proliférer soit par s’empilent sur les uns les autres comme des foyers ou en suspension, même après que la surface de croissance a été couverts (Figure 1). Toutefois, utilisateurs expérimentés avec des lignées cellulaires spécifiques peuvent utilisent souvent confluence comme un guide visuel rapid pour quand à la sous-culture.

Bien qu’il soit possible de faire pousser des lignes de drosophile à ta ambiant entre 19−25 ° C, il n’est pas recommandé car les fluctuations de la température ambiante peuvent affecter le taux de prolifération. L’utilisation d’un incubateur dédié 25 ° C est recommandée. L’incubateur pour les cultures de cellules de drosophile ne doit pas faciliter l’échange de gaz CO2 milieux de culture cellulaire de drosophile n’utilisant pas de CO2 pour la mise en mémoire tampon. L’humidité à l’intérieur de l’incubateur de culture de lignées cellulaires est un facteur important ne pas à négliger lorsque cultivant les cellules en plaques. Selon le type sur l’incubateur et le milieu de travail, il peut être nécessaire de placer un bécher d’eau stérile à l’intérieur de l’incubateur. Pour minimiser l’évaporation de médias, utiliser un T-flacon fermé ou stocker les plaques de culture dans un récipient en plastique hermétique à l’intérieur de l’incubateur.

Il est important d’établir un calendrier pour le repiquage des lignées de cellules de drosophile . Pour évaluer la cohérence de moniteur et le taux de croissance, il est commode de sous-culture à un rapport même géométrique (split ratio 1:2, 1:4, 1:8). Par exemple, une plaque de 10 mL confluentes de cellules Kc167 à 8 x 106 cellules/mL peut être dédoublée au ratio de 1:8 pour atteindre une densité de semis de 1 x 106 cellules/mL (1,25 mL de suspension cellulaire diluée dans 8,75 mL de supports neufs). En 72 h, cultures Kc167 sont censés se multiplient à une densité de 8 x 106 cellules/mL, compte tenu de son temps de doublement de 24h. Par conséquent, le coefficient de fractionnement est déterminé pour faciliter une routine de pratique sous-culture de jusqu’à deux fois par semaine, veiller à ce que les cellules sont toujours cultivées dans leur phase de log exponentielle de croissance. Cela permet un horaire régulier pour le repiquage des cellules, afin que le temps de confluence est ni trop court ni trop long. Si le temps de confluence est trop court, les cellules sont repiquées à une plus faible densité cellulaire (ratio plus élevé de split). De même, si le temps d’atteindre le confluent est trop long, les cellules sont repiquées à une densité plus élevée de la cellule (plus faible ratio de partage). Il est important de noter que la plupart des lignées de cellules Drosophila sont très sensibles à faible densité (< 1 x 105 cellules/mL), dans lesquels les cellules guère prolifèrent et peuvent finissent par mourir.

Lignées cellulaires Drosophila varient dans la morphologie et les caractéristiques de croissance. Ainsi, les lignées de cellules ayant des propriétés distinctes peuvent avoir à être traités différemment. La plupart des lignées de cellules Drosophila sont semi adhérentes. À plus faible densité cellulaire, ils adhèrent plus à la surface de croissance et de la culture devienne confluente, les cellules deviennent moins adhérentes et détachement facilement. Ce changement graduel dans l’adhérence cellulaire facilite le repiquage facile des lignées de cellules plus largement utilisés Drosophila (Schneider, lignes Kc, disque imaginal et CNS) car il permet à l’opérateur de renoncer simplement médias au cours de la monocouche cellulaire à déloger de la surface de croissance lorsque la culture est dense. Pour les lignes qui sont les surfaces adhérentes telles que la lignée germinale femelle tige/ovaire somatique gaine (fGS/OSS) et les lignes de Ras, il est essentiel d’incuber les cellules en trypsine pour une courte durée aider à détacher les cellules de la surface de croissance.

Ajouts de Media pour la plupart des lignées de cellules Drosophila comprennent le sérum de veau foetal (FCS). Insuline et extrait de mouche adulte (FEX) sont nécessaires pour certaines lignes spécifiques. FEX contient indéfinis composants essentiels à la croissance des disques imaginaux larvaire spécifiques et les lignes de cellules ovariennes adultes. La DGRC prépare et fait FEX adulte disponible issues 1 semaine vieux Oregon-R-modENCODE mouches (IDRM : BDSC_25211) en aliquotes de 2,5 mL et 10 mL. La DGRC fournit également des instructions pour à petite échelle préparation FEX sur son site Internet . Préparation de FEX, cependant, prend du temps et nécessite une grande quantité de mouches adultes.

La cryoconservation des lignées de cellules de drosophile économise temps et réactifs pour le maintien des lignées cellulaires pas dans une utilisation immédiate. Cryoconservation est obtenue par congélation lentement les cellules (-1 ° C/min) à-80 ° C dans un milieu contenant un agent cryoprotecteur DMSO. L’étape de refroidissement lent est critique pour la cryoconservation réussie. Dans un congélateur à-80 ° C, l’ampule de cellules est refroidi à raison de-1 ° C/min lorsqu’il est placé dans un récipient de congélation rempli avec de l’isopropanol. À partir de la température ambiante de 25 ° C, il faudra jusqu’à 2 h pour que la température dans les ampoules pour atteindre-80 ° C. Il est recommandé de laisser les ampoules de geler pendant la nuit.

Ampoules congelées doivent alors être rapidement transférés dans la phase liquide de l’azote pour une conservation prolongée. À température ambiante, le cryovial va réchauffer rapidement à environ 10 ° C/min et la viabilité sera compromise à au-dessus de-50 ° C,23. Pour garder le transfert rapide, gérer les ampoules en petits lots pour minimiser l’exposition à la température ambiante. Sinon, placer la cryovials congelés sur la glace sèche tout en préparant leur transfert dans le liquide N2. Si l’azote liquide n’est pas disponible, les cellules peuvent être entreposés dans un congélateur à-80 ° C, bien qu’avec un risque de détérioration significative au fil du temps.

Densité cellulaire est critique pour la cryoconservation réussie et la reprise ultérieure des lignées cellulaires. En général, nouvelle cellule lignes devraient être gelés pour créer le premier gel (1−3 ampoules) dès qu’un excès de cellules est disponible. Une fois que la lignée cellulaire a été cultivée plus stablement, un stock congelé de 10−20 ampoules doit être créé. Ce stock est ensuite décongelé pour vérifier sa récupération après gel cellulaire et viabilité, après quoi il est propagé d’expérimentations ou de remplacer le stock lorsque le nombre d’ampoules stocks congelés est inférieur à cinq. Enfin, il est important de valider que les cellules dégelées conservent les caractéristiques de son cheptel parental comme les lignées cellulaires sont connues d’évoluer3,24.

En conclusion, cet article présente une couche d’apprêt pour travailler avec des cultures de cellules de drosophile en fournissant les renseignements fondamentaux sur les diverses lignes, meilleures pratiques et protocoles audiovisuels pour le maniement de base de lignées cellulaires de drosophile . Cette ressource accessible est destinée à soulager en douceur l’introduction de travailler avec des cellules de drosophile et en complément des guides de formation existant dans tout laboratoire de recherche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les National Institutes of Health (NIH de prix P40OD010949) et le milieu de la recherche utilisant les différentes ressources d’ADN/vecteur/cellule de d. melanogaster , à la DGRC.

Materials

100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting
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Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).
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