ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية
Summary
خطوط الخلية المورفولوجية هي الكواشف هامة للبحوث الأساسية والطب الأحيائي على حد سواء. توفر هذه المقالة بروتوكولات لذوبان الجليد، وسوبكولتورينج، ونعد من خطوط الخلايا المورفولوجية المستخدمة عادة لمساعدة الباحثين في إدماج استخدام هذه الكواشف في أبحاثهم.
Abstract
وهناك حاليا أكثر من 160 خطوط الخلية المورفولوجية متميزة موزعة حسب مركز الموارد المورفولوجية الجينوم (دجرك). مع هندسة الجينوم، يتوقع العدد خطوط الخلايا رواية زيادة. دجرك يهدف إلى تعريف الباحثين باستخدام خطوط الخلايا المورفولوجية كأداة تجريبية لتكملة ودفع جدول أعمالهم البحثية. وترد الإجراءات المتعلقة بالعمل مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المورفولوجية ذات الخصائص المميزة، بما في ذلك البروتوكولات لذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا. الأهم من ذلك، يوضح هذا المنشور أفضل الممارسات اللازمة للعمل مع خطوط الخلايا المورفولوجية التقليل من مخاطر التلوث من الكائنات المجهرية العارض أو من خطوط الخلايا الأخرى. الباحثين الذين أصبحوا على دراية بهذه الإجراءات سيكون قادراً على الخوض في العديد من التطبيقات التي تستخدم الخلايا المورفولوجية مثقف بما في ذلك الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا وعلم الجينوم الوظيفي.
Introduction
استخدام المورفولوجية استزراع الخلايا يكمل المجراة في الطيران التحليل الجيني ويخدم كأداة تحقيق الابتدائي لمعالجة العديد من المسائل البيولوجية الأساسية1،،من23. وتوفر خطوط الخلايا المورفولوجية السكان متجانسة فريدة من الخلايا المشتقة من مصادر مختلفة من الأنسجة مع الخلفيات الوراثية المتميزة. خطوط الخلية مناسبة للعديد من التطبيقات بما في ذلك تعبير الجينات المعدلة وراثيا، وعلم الجينوم، transcriptomics، البروتيوميات، جميع، إنتاجية عالية الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) الشاشات وبيولوجيا الخلايا والفحص المجهري. الأهم من ذلك، يسهل استخدام المورفولوجية خلية ثقافة توصيف الردود الزمانية المباشرة للمنبهات المعروفة. وعلاوة على ذلك، المورفولوجية خلية ثقافة قابلة للجينوم كريسبر-Cas9 والتحرير، مما يجعل من السهل نسبيا لإنشاء خطوط الخلايا الجديدة مع الجينوم محددة التعديلات4،،من56، 7.
بمثابة مركز الموارد الجينومية المورفولوجية (دجرك) مركز المستودع وتوزيع لخطوط الخلايا المورفولوجية . أحد الأهداف دجرك مساعدة أعضاء المجتمع للبحث في استخدام موارد الثقافة الخلية المورفولوجية . ويعرض هذا المقال البروتوكولات الأساسية للتعامل مع خطوط الخلايا المورفولوجية . وهو يكمل الموارد الموجودة لمساعدة الباحثين تصبح مريحة مع التعامل مع الثقافات الخلية المورفولوجية وتحقيق مستوى استقلال في تلك التجارب1،2،8،9 ،10.
خطوط الخلية المورفولوجية الأكثر استخداماً: خطوط شنايدر11، Kc16712، قرص imaginal ميتسوبيشي/مياكي والجهاز العصبي المركزي (CNS) خطوط13،14، ميلنر مختبر القرص imaginal خطوط 15،16،خطوط الخلايا المبيض البالغين17، و خطوط رأس18 (الجدول 1). خطوط شنايدر و Kc167 خطوط الخلية جميع الأغراض العامة لاستخدامها في الكيمياء الحيوية والجينات المعدلة وراثيا المؤتلف، وعكس شاشات الجينية. خطوط المختبرية (ML) ميتسوبيشي/مياكي مستمدة من أقراص imaginal اليرقات أو الجهاز العصبي المركزي (CNS) وأنها كانت مفيدة للدراسات المتعلقة نيوروسيكريشن وتنظيم النسخ، وتجهيز الجيش الملكي النيبالي. وكانت خطوط القرص ميلنر (CME) هامة لدراسة توصيل الإشارة. تبقى خطوط الخلايا fGS/برمجيات المصدر المفتوح المستمدة من المبايض الكبار متحولة الكواشف هامة لدراسة التأثير غير الترميز البيولوجيا رنا الصغيرة في الخلية الجرثومية الصيانة والتمايز17،19. وأخيراً، خطوط رأس فريدة من نوعها لأن هذه خطوط الخلايا المشتقة من الأجنة اكتوبيكالي الإعراب عن السرطاني Ras. أنهم على التوقيع النسخي خلايا السلائف العضلات، وتعرب عن piRNA النشطة الآلية20. الأخيرة مراجعة المقالات وفصول الكتب تغطي الطلبات المقدمة من هذه الخطوط الخليوي شعبية مع مزيد من التفاصيل2،3،9.
يمكن سوبكولتوريد جميع خطوط الخلية هذه والمجمدة. هناك متطلبات مختلفة طفيفا ولكن هاما لكيفية المحافظة على كل خط الخلية ومستعدة لتجميد. على سبيل المثال، خطوط الخلايا متميزة تتطلب وسائل الإعلام المختلفة والمكملات الغذائية (الجدول 1). الخطوط تختلف أيضا في خصائص الالتزام السطحية، مورفولوجيس (الشكل 1 و الشكل 2)، النمط الوراثي ومضاعفة الوقت (الجدول 2). نحن الحاضر البروتوكولات الأساسية، وتسليط الضوء على الاختلافات فريدة من نوعها للتعامل مع خطوط الخلية المورفولوجية المختلفة المستخدمة على نطاق واسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
المورفولوجية خلية الثقافات هي الكواشف الأولية للشاشات المستندة إلى خلية إنتاجية عالية. ويكمل استعمالها أيضا المجراة في البحوث الجينية بتوفير عدد سكان متجانسة من الخلايا مناسبة للكيمياء الحيوية واختبار نيات المعدلة وراثيا قبل الحقن في الذباب وبيولوجيا الخلايا، والفحص المجهري، وفي الآونة الأخيرة الخلية الجسمية الوراثي السريع التلاعب جينوم التحرير1،2،3،،من89،10.
البقاء والانتعاش المجمدة المورفولوجية الخلايا حساس لتقلبات جذرية حتى في درجات الحرارة المنخفضة. دجرك يخزن خطوط الخلايا المجمدة في الطور السائل (-196 درجة مئوية) ن2 وينقلهم في الثلج الجاف (-78.50 درجة مئوية). ينبغي عدم نقل امبولات المجمدة التي تنقل في الثلج الجاف إلى السائل ن2 أو ثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين. بدلاً من ذلك، ينبغي أن تكون إذابة الخلايا المجمدة وريسيديد في كثافة عالية خلية وقت ممكن عند الوصول (المادة 1 من البروتوكول) ومثقف لأغراضها (القسم 3 من البروتوكول). إذا لم تستخدم خطوط الخلية فورا لإجراء تجارب عليها، cryopreserved الخلايا يجب أن تكون الأسطر (المادة 6 من البروتوكول) حتى تكون جاهزة للاستخدام.
بعض خطوط الخلايا، مثل خطوط مل-BG2-c2 و Ras بحاجة إلى عدة أيام للتعافي من آثار يجري إحياؤها من الدولة كريوبريسيرفيد. كمية كبيرة من الحطام الخلوية ترافق هذه خطوط الخلايا في الأيام القليلة الأولى بعد ذوبان الجليد. بقي دون عائق، سيتم استرداد الخلايا وتتكاثر. وقد تم العديد من خطوط الخلايا المورفولوجية في دجرك تكييف تنمو في M3 تقوم وسائل الإعلام22. لخطوط الخلايا التي تكون بطيئة للتعافي من آثار ذوبان الجليد، قد يكون من المفيد استخدام وسائل مكيفة. يحتمل مكيفة الوسائط تحتوي على عوامل النمو يفرز من الخلايا إلى وسائل الإعلام التي قد تشجع على الانتعاش وانتشار الخلايا بعد ذوبان الجليد.
تتبع خطوط الخلايا عموما منحنى نمو نمطية المكونة من مرحلة انتقالية ومرحلة الأسى، مرحلة الهضبة ومرحلة تدهور. تنتشر العديد من خطوط الخلايا المورفولوجية في السجل-مرحلة النمو عند أنها تستزرع في كثافة بين 1 × 106 و 1 × 107 خلايا/مل عند 25 درجة مئوية. فمن الضروري أن خطوط الخلية هي باساجيد أن هم دائماً في مرحلة النمو الأسى.
التقاء الثقافة، كنسبة مئوية، يصف نمو المساحة التي تغطيها خلايا. التقاء خلية لخط خلية يعتمد على خلية الشكل والحجم. خطوط الخلية متميزة لها مورفولوجيس مختلفة وخصائص الانضمام. كنتيجة لذلك، قد يكون خطوط الخلايا المختلفة في التقاء مماثلة تقريبا كثافة الخلايا متميزة إلى حد كبير (الشكل 1). قد لا يكون التقاء الثقافة مؤشرا مثاليا باساجينج الثقافات الخلية المورفولوجية لخطوط الخلايا المورفولوجية لا تزال تتكاثر أما بواسطة تتراكم فوق بعضها البعض البؤر أو في تعليق حتى بعد سطح النمو غطت (الشكل 1). ومع ذلك، المستخدمين ذوي الخبرة مع خطوط الخلايا المحددة قد غالباً ما تستخدم التقاء كدليل مرئي سريع لعند إلى ثقافة فرعية.
وفي حين أنه من الممكن أن تنمو المورفولوجية خطوط المحيطة RT بين 19−25 درجة مئوية، لا ينصح لتقلبات درجة الحرارة المحيطة قد تؤثر على معدل انتشار. يوصي باستخدام حاضنة مخصصة 25 درجة مئوية. لا تحتاج حاضنة للثقافات الخلية المورفولوجية لتيسير تبادل الغازات CO2 أن لا تستخدم المورفولوجية خلية ثقافة الإعلام CO2 للتخزين المؤقت. الرطوبة داخل الحاضنة لاستزراع خطوط الخلية عاملاً هاما لا يمكن تجاهلها عند استزراع الخلايا في لوحات. اعتماداً على نوع حاضنة وبيئة العمل، قد يكون من الضروري لوضع كوب الماء المعقم داخل الحاضنة. للتقليل من تبخر وسائل الإعلام، استخدام T-قارورة مغلقة أو تخزين لوحات الثقافة في وعاء من بلاستيك محكم مختومة بينما داخل الحاضنة.
من المهم وضع جدول زمني سوبكولتورينج خطوط الخلايا المورفولوجية . لتقدير مدى اتساق مراقبة ومعدل النمو، أنها ملائمة لثقافة فرعية في نسبة حتى هندسية (تقسيم نسبة 1:2, 1:4, 1:8). على سبيل المثال، يمكن تقسيم لوحة المتلاقية 10 مل من الخلايا Kc167 في 8 × 106 خلايا/مل في نسبة 1:8 لتحقيق كثافة بذر 1 × 106 خلايا/مل (1.25 مل تعليق خلية مخفف إلى 8.75 مل وسائط جديدة). ح 72، يتوقع أن تنتشر بكثافة 8 × 106 خلايا/مل، نظراً لمضاعفة وقت ح 24 الثقافات Kc167. ولذلك نسبة تقسيم عازمة على تسهيل روتين ثقافة فرعية ملائمة لتصل إلى مرتين في أسبوع، ضمان أن الخلايا تستزرع دائماً في مرحلة سجل المتسارع النمو. وهذا يسمح لجدول منتظم سوبكولتورينج الخلايا حيث يكون الوقت لالتقاء لا قصيرة جداً أو طويلة جداً. إذا كان الوقت لالتقاء قصيرة جداً، هي سوبكولتوريد الخلايا في خلية أقل كثافة (أعلى نسبة الانقسام). وبالمثل، إذا كان الوقت للتوصل إلى التقاء طويل جداً، هي سوبكولتوريد الخلايا في كثافة خلية أعلى (انخفاض نسبة الانقسام). من المهم أن نلاحظ أن معظم خطوط الخلية المورفولوجية حساسة جداً لخلية منخفض الكثافة (< 1 × 105 خلايا/مل)، وفي الخلايا التي لا يكاد تتكاثر وقد يموت في نهاية المطاف.
تختلف خطوط الخلايا المورفولوجية في خصائص النمو والتشكل. كنتيجة لذلك، قد يكون خطوط الخلايا مع خصائص مميزة التعامل معها بشكل مختلف. معظم خطوط الخلية المورفولوجية شبه ملتصقة. في انخفاض كثافة الخلية، أنها تلتزم بأقوى سطح النمو وعندما تصبح الثقافة المتلاقية، الخلايا تصبح أقل ملتصقة وفصلها بسهولة. يسهل هذا التغيير التدريجي في الخلية الانضمام سوبكولتورينج سهلة لخطوط الخلايا المورفولوجية الأكثر استخداماً (شنايدر، خطوط كيه سي والقرص إيماجينال وخطوط الجهاز العصبي المركزي) كما أنه يسمح للمشغل ببساطة التخلي عن وسائل الإعلام على مدى المونولاير خلية لإزاحة لهم من على سطح النمو عند الثقافة كثيفة. للخطوط التي ملتصقة السطحية مثل خط جرثومة الإناث غمد جسدية الجذعية/المبيض (fGS/برمجيات المصدر المفتوح) وخطوط Ras، الضروري لاحتضان الخلايا في التربسين لمدة قصيرة للمساعدة في فصل الخلايا من سطح النمو.
وتشمل الإضافات وسائل الإعلام لمعظم خطوط الخلية المورفولوجية مصل العجل الجنين (FCS). الأنسولين واستخراج يطير الكبار (FEX) مطلوبة من أجل بعض بنود محددة. FEX يحتوي على غير معرف مكونات أساسية لنمو خطوط محددة القرص imaginal اليرقات وخطوط الخلايا المبيض البالغين. تستعد دجرك، ويجعل FEX الكبار المتاحة المستمدة من 1 أسبوع من العمر أوريغون-R-مودينكودي الذباب (رريد: BDSC_25211) في مختبرين 2.5 مل و 10 مل. دجرك أيضا يوفر إرشادات حول صغيرة الحجم إعداد FEX على موقعها . ومع ذلك، إعداد FEX، تستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب كمية كبيرة من الذباب الكبار.
تجميد خطوط الخلية المورفولوجية يوفر الوقت والمواد الكاشفة لصيانة خطوط الخلايا لا في الاستخدام الفوري. للواسمات يتحقق عن طريق تجميد الخلايا (-1 درجة مئوية/دقيقة) ببطء إلى-80 درجة مئوية في متوسط تحتوي على [دمس]، عامل كريوبروتيكتيفي. خطوة التبريد البطيء أمر حاسم لنجاح تجميد. في ثلاجة-80 درجة مئوية، يتم تبريد ampule الخلايا بمعدل قدرة-1 درجة مئوية/دقيقة عند وضعها في حاوية تجميد مليئة بالكحول. بدءاً من 25 درجة مئوية درجة الحرارة المحيطة، سوف يستغرق ما يصل إلى 2 س لدرجة الحرارة في امبولات تصل إلى-80 درجة مئوية. من المستحسن ترك امبولات لتجميد بين عشية وضحاها.
يجب سرعة ثم نقل امبولات المجمدة في الطور السائل من النيتروجين للتخزين فترات طويلة. في درجة حرارة الغرفة، وسوف يسخن كريوفيال سرعة في حوالي 10 درجة مئوية/دقيقة وسوف يتعرض للخطر في البقاء أعلاه-50 درجة مئوية23. للاحتفاظ بالنقل سريع، التعامل مع امبولات على دفعات صغيرة لتقليل التعرض لدرجة الحرارة المحيطة. وبدلاً من ذلك، وضع كريوفيالس المجمدة على الثلج الجاف بينما كان يستعد لنقلها إلى سائل ن2- إذا لم يتوفر النيتروجين السائل، قد يتم تخزين الخلايا في ثلاجة-80 درجة مئوية، على الرغم من أن تنطوي على خطر تدهور كبير على مر الزمن.
كثافة الخلية أمر بالغ الأهمية لنعد الناجحة، وإحياء خطوط الخلايا اللاحقة. وبصفة عامة، تجميد خلية جديدة ينبغي تجميد خطوط لإنشاء الأولية (امبولات 1−3) حالما يتوفر فائض في الخلايا. بمجرد قد تم خط الخلية مثقف كذلك ستابلي، ينبغي إنشاء مخزون مجمدة من امبولات 10−20. ثم يتم إذابة هذا المخزون للتحقق للانتعاش بعد تجميد الخلايا والجدوى، بعد ذلك يتم نشر للتجريب أو لاستبدال المخزون عندما ينخفض عدد امبولات الأرصدة المجمدة أقل من خمس. وأخيراً، من المهم التحقق من أن الخلايا المذابة الاحتفاظ بخصائص الأسهم الأبوية كما هي معروفة خطوط الخلايا تتطور3،24.
وفي الختام، يقدم هذا المقال تمهيدي للعمل مع الثقافات الخلية المورفولوجية بتوفير المعلومات الأساسية عن مختلف خطوط، وأفضل الممارسات، والبروتوكولات السمعي البصري على المعالجة الأساسية لخطوط الخلايا المورفولوجية . هو يعني هذا المورد موجوداً لتخفيف مقدمة للعمل مع مثقف المورفولوجية الخلايا بسلاسة واستكمال الأدلة التدريبية الموجودة في أي مختبر البحوث.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “المعاهد الوطنية للصحة” (المعاهد الوطنية للصحة جائزة P40OD010949) ومجتمع البحوث للاستفادة من الموارد الحمض النووي/ناقل/خلية melanogaster دال- الفني في دجرك مختلف.
Materials
| 100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
| 25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
| 35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
| Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
| Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
| Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
| Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
| Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
| Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
| Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
| Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
| Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
| L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
| Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
| Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
| Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
| Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
| Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |
References
- Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).
- Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
- Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
- Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
- Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
- Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
- Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
- Echalier, G. . Drosophila Cells in Culture. , (1997).
- Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. . Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).
- Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. . Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
- Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
- Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
- Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
- Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
- Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
- Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
- Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
- Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).
- Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).
