解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

急速に凍結ショウジョウバエ細胞を解凍し、成長段階に戻って文化をもたらす細胞密度でそれらを文化することが重要です。凍結と融解のため手順を遵守している場合 T-25 フラスコ細胞密度、少なくとも 4 x 106セル/mL と等しくなります。解凍後、1 ~ 2 時間ほとんどショウジョウバエ細胞成長表面に添付する開始されます。ほとんどのセルの接続されていないの成長表面融解後 2 時間以内の状況下では、メディアを変更する前に一晩細胞をインキュベートすることをお勧めします。 培養の目的は、成長曲線の健康指数ログ段階の細胞を維持するためにです。培養の条件は、microorganismal 汚染、細胞密度、および定期的なメンテナンス スケジュールを確立する必要性の表示の欠乏によって異なります。まず、細胞の健康を評価し、凍結前に不定汚染物質の有無を判断することが重要です。ほとんどの細菌や真菌の汚染物質が目視検査で単に検出.汚染された文化は、メディアの濁度の増加によって識別できます。顕微鏡で細菌棒、出芽酵母や文字列のような菌糸は球菌汚染物質が表示されます。その他非変性のマイコ プラズマなど汚染の源は視覚的に検出することはできず、PCR に基づく試金21によって定期的にテストすることができます。 セルラインの合流点を視覚的に決定することができます (図 1)。高速成長している細胞は早く合流点に達するし、定期的に継代する必要があります。このような行は週に 2 回まで継代します。対照的に、遅い成長細胞は継代 2 週間ごとに少なくとも 1 回以上です。ただし、セルは、毎週新鮮なメディアを供給する必要があります。これはメディアの枯渇を防ぐために、細胞からの代謝廃棄物を希釈します。セルの行は、ソースの違い自分の形態 (図 2)、密着性、メディアの要件 (表 1) は組織の変化と倍加時間 (表 2) から派生します。表 5表 6表 7表 8様々 なショウジョウバエの細胞培養媒体のためのレシピを一覧表示します。 セルを数えるには、正確な播種密度と培養のための予測可能なルーチンが保証されます。定量的な実験は、細胞数が不可欠です。(図 3 a) 検定または (図 3 b) 自動パーティクル カウンターを使用して、セルがカウントされます。自動カウンターを使用している場合は、製造元の指示をに従ってください。手動でセルを数えると、経済的で簡単診断を使用です。中間ノイバウアー格子で囲まれているセルの数をカウントし、細胞密度が計算されます。たとえば、n = 214 細胞、106セル/mL (図 3 D) x 2.14 の細胞密度の結果します。 2 つの 100 mm プレート、各 10 mL を含む 4 × 106セル/mL の細胞懸濁液から細胞を懸濁液は収集および 4 x 107細胞/ml の密度を達成するためにメディアを凍結の 2 mL で再停止されます。細胞懸濁液 0.5 mL を各冷凍クリオバイアルには 2 x 10 の7セルが含まれます。これは 4 x 106セル/mL プロトコルのセクション 1 に従って解凍時の文化になります。 図 1:3 つの異なる代表的な画像ショウジョウバエ細胞の合流およびセル密度を異にします。(A) S2 DGRC 文化で 1 × 106セル/mL。(A’)4.5 x 106セル/mL で S2 DGRC 文化。(B) ML BG2 c2 は 2 × 106セル/mL で文化します。(B’)ML BG2 c2 文化 8 x 106セル/mL 細胞を積み、巣として集約します。(C) OSS 文化 1 × 106セル/mL。(C’)4 x 106セル/mL で OSS 文化。懸濁液中の細胞は同じ焦点面にはキャプチャされません。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  図 2: 8 つの明瞭なショウジョウバエ細胞ラインの代表的なイメージです。(A) ラウンド胚派生 S2 DGRC。(B) ラウンド由来胚 Kc167。 (C) 幼虫中枢神経系由来 ML-BG2-c2 をラウンド。(D) ラウンドの幼虫は、ML BG3 c2 を紡錘形に。(E) CME L1、幼虫脚成虫原基由来細胞株は小さいで、ラウンド/紡錘状の形態。(F) OSS、大人卵巣由来細胞株には、紡錘状の形態が表示されます。(G) RasV12の紡錘形細胞ラインを表現すると、Ras が活性化。(H) RasV12; wtsRNAi (WRR1) 活性化 Ras と二本鎖 RNA 腫瘍サプレッサー疣贅(wts) をターゲットを表現する細胞株は、上皮の特性を表示します。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 細胞密度をカウントするには、診断を使用して手動でまたは自動的に自動化されたパーティクル カウンターを使用します。(A) A 検定二室。(B) 細胞数の出力を表示する自動化された細胞カウンター。(C) 改良されたノイバウアー セルカウント グリッド 10 × 対物の下に表示。0.1 mm3中央グリッド (赤い破線広場) に拘束のセルをカウントします。(D)、検定の中央のグリッドは、カウントのための細胞でいっぱい。スケール バー = 1 mm (C);0.2 mm (D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: 凍結保存装置。(A) A 凍結容器の店直立位置でアンプル緩慢凍結のため。(B) A 凍結アンプルを保持するための金属の杖。(C) A キャニスター杖を保持するため。(D) A のプラスチック冷凍の箱 (cryobox)。(E) A 容器液 N2ストレージ タンクに挿入された複数の杖を保持しています。(F) 液体 N2タンク。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 細胞株 メディア 遵守 トリプシン シュナイダー線 M3 + BPYE + 10% 牛胎児血清 (FCS)、pH 6.6 半付着 違います (S2R + S2 DRSC、S2-DGRC、Sg4)11 シュナイダーのメディア+ + 10% FCS Kc ライン (Kc167、Kc7E10)21, 22 M3 + BPYE + 5 s、pH 6.6 半付着 違います Hyclone CCM3、pH 6.2 成虫ディスクと中枢神経系 (ML ライン)13, 14 M3 + BPYE + 10 s、pH 6.6 半付着 違います 10 μ G/ml インスリン ミルナー成虫ディスク ライン (CME 行)15 M3 + 2% の FCS 半付着 違います 5 μ g/mL インスリン 2.5% フライ エキス fGS oss では,16 M3 + 10 s、pH 6.8 付着性 * 10 μ G/ml インスリン 1 mg/mL C5H8自演4   0.5 mg/mL KHCO3  0.6 mg/mL グルタチオン 10% フライ エキス RasV12行18 M3 + BPYE + 10 s、pH 6.6 付着性 うん 表 1:各種のプロパティとメディアの要件ショウジョウバエ細胞株。S2R +、S2-ショウジョウバエ RNAi スクリーニング センター (DRSC)、S2-ショウジョウバエ ゲノム リソース センター (DGRC)、および sg4 という名前を含む半付着のシュナイダー ラインの異なる菌株が M3 媒体で培養した場合確実に増殖細胞の一般的に使用される +Bactopetone 酵母エキス (BPYE) 10% 牛胎児血清 (FCS) を添加しました。また、シュナイダーのメディア (pH 6.7 6.8)、M3 + BPYE の代わりに使用されます。M3 + BPYE Kc 行増殖 (5% の FCS) または無血清 CCM3 メディア。ML 成虫ディスクと中枢神経系 (CNS) 行増殖のインスリン補充が必要。ミルナー成虫ディスク ラインは、インスリンとフライ エキスが摂取を必要とします。付着 fGS oss では, 細胞の成長のためインスリン、フライのエキスとしてグルタチオンの高濃度が必要です。付着性 RasV12ラインは M3 + BPYE でよく育つ (10 s)。トリプシンは、成長面から付着性のセルラインを取り除くために使用されます。 細胞 (# ストック) 遺伝子型 倍加時間 (h) * 組織のソース S2R + (150) 動体 39 遅い胚 S2 DGRC (6) 動体 23 遅い胚 S2 DRSC (181) 動体 46 遅い胚 Kc167 (1) e/se 22 6−12 h 胚 ML BG2 c2 (53) y v f マル 48 3rd齢幼虫中枢神経系 ML BG3 c2 (68) y v f マル 104 3rd齢幼虫中枢神経系 ML DmD8 (92) y v f マル 66 3rd齢幼虫翼ディスク CME W1 Cl.8+ (151) 動体 46 3rd齢幼虫翼ディスク CME L1 (156) 動体 47 3rd齢幼虫脚ディスク OSS (190) 体86 45 アダルトbam変異卵巣 RasV12行 UA-GFP。P(UAS-Ras85D.V12)/P (Act5C GAL4) 17bFO1 41−65 胚 表 2:遺伝子型、倍加時間とのティッシュ ソースを広く使用ショウジョウバエ細胞株。組織の遺伝子型、ソース、倍加時間は一般的に使用される細胞の人口が掲載されています。倍加時間は 25 ° C で推奨メディアの成長に基づいて 培養器 メディア (mL) のボリューム 12.5 cm2 T フラスコ 2.5 25 cm2 T フラスコ 5 75 cm2 T フラスコ 15 35 mm プレート 1 60 mm の板 4 100 mm の板 10 384 ウェル プレート * 0.04/ウェル 96 ウェル プレート * 0.1/ウェル 48 ウェル プレート * 0.3/ウェル 24 ウェル プレート * 0.5/ウェル 12 ウェル プレート 1.0/ウェル 6 ウェル プレート 2.0/ウェル テーブル 3: 培養容器および推奨メディア ボリューム。様々 なサイズの培養容器はショウジョウバエ細胞を培養です。適切なメディア ボリューム (mL) は、各容器に適しています。メディア蒸発による損失を低減するパラフィン フィルム細胞懸濁液 0.5 mL 未満を含むウェル プレートをシールします。 ボリューム M3 + BPYE、pH 6.6 70 mL 熱は、FCS を不活化 20 mL 滅菌フィルター DMSO * 10 mL 表 4: 凍結中 (M3 + BPYE、20% の FCS 10 %dmso) 100 mL を準備するためのレシピです。必要に応じて凍結メディアを準備し、長時間の DMSO を含む凍結のメディアを格納するを回避します。 M3 + BPYE 媒体 量 盾し、歌ったの M323 1 ボトル KHCO3 0.5 g 選択酵母エキス 1.0 g Bactopeptone 2.5 g 滅菌精製水 1000 mL 表 5:M3 + BPYE の 1 L の準備のためのレシピ組織培養培地。6.6 pH を調整します。0.22 μ m のフィルターを介してメディアを渡すことによって殺菌します。 FGS/OSS セルラインの基本の M3 媒体 量 盾し、M3 を歌った 1 ボトル KHCO3 0.5 g C5H8自演4   1.0 g 滅菌精製水 1,000 mL 表 6:FGS/OSS M3 基本培地 1 L のレシピ。6.8 pH を調整します。0.22 μ m のフィルターを介してメディアを渡すことによって殺菌します。 Hyclone CCM3 量 CCM3 パウダー 28.6 g NaHCO3 0.35 g 10 N NaOH 2.5 mL CaCl2 0.5 g 滅菌精製水 1,000 mL 表 7:Hyclone CCM3 組織培養培地の 1 L のレシピ。6.2 に pH を調整します。0.22 μ m のフィルターを介してメディアを渡すことによって殺菌します。 M3 + BPYE + 10% FCS 三宅ディスクと CNS 行中 ミルナー ディスク行中 fGS/OSS 完全培地 M3 + BPYE、pH 6.6 90 mL 90 mL – – 熱不活化 FCS * 10 mL 10 mL 2 mL 10 mL インスリン (10 mg/mL) – 100 Μ L 50 Μ L 100 Μ L エキスを飛ぶ – – 2.5 mL 10 mL グルタチオン (60 mg/mL) – – 1 mL M3、pH 6.6 – – 97.5 mL – fGS/OSS M3、pH 6.8 – – 79 mL テーブル 8:様々 な共通の 100 mL の準備のためのレシピショウジョウバエ細胞の培養基。FCS を 56 ° C 1 時間インキュベートし、補体タンパク質を熱不活化する 5 分ごとを振る。