Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий
Summary
Линии клетки дрозофилы являются важными реагенты для фундаментальных и биомедицинских исследований. Эта статья обеспечивает протоколы для оттаивания, subculturing и криоконсервации часто используемых дрозофилы клеточных линий для оказания помощи исследователям в посредством использования этих реагентов в их исследованиях.
Abstract
В настоящее время насчитывается более 160 различных клеточных линий дрозофилы , распределены по дрозофилы центр ресурсов геномики (НАУЧНЫМ). С инженерной генома, количество новых клеточных линий ожидается увеличение. НАУЧНЫМ призвана ознакомить исследователей с использованием дрозофилы клеточных линий как экспериментальный инструмент для дополнения и управлять их исследований. Предоставляются процедуры для работы с различными дрозофилы клеточных линий с отличительные особенности, включая протоколы для оттаивания, культивирования и cryopreserving клеточных линий. Важно отметить, что эта публикация демонстрирует лучшие практики, необходимые для работы с дрозофилы клеточных линий для сведения к минимуму риска загрязнений от случайного микроорганизмов или других клеточных линий. Исследователи, которые стали знакомы с этими процедурами будут иметь возможность углубиться в многих приложений, использующих дрозофилы культивируемых клеток, включая биохимии, клеточной биологии и функциональной геномики.
Introduction
Использование дрозофилы культивируемых клеток дополняет в естественных условиях летать генетического анализа и служит в качестве первичного расследования инструмент для решения многих основных биологических вопросов1,2,3. Дрозофилы клеточных линий предлагают уникальные однородной популяции клеток, полученных из источников различных тканей с различных генетических стола. Клеточные линии подходят для многих приложений, включая выражение трансгенных гена, геномики, transcriptomics, протеомики, метаболомики, высокая пропускная способность РНК интерференции (RNAi) экранов, клеточной биологии и микроскопии. Важно отметить, что использование дрозофилы клеточной культуры облегчает характеристику немедленного временного ответы на известных раздражителей. Кроме того культура клетки дрозофилы поддается ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генома редактирования, что делает его относительно легко создать новые линии клетки с конкретным геном модификации4,5,6, 7.
Центр ресурсов дрозофилы геномики (НАУЧНЫМ) выступает в качестве репозитория и распределительный центр для дрозофилы клеточных линий. Одна из целей НАУЧНЫМ заключается в оказании помощи членам научно-исследовательского сообщества в использовании ресурсов культуры клеток дрозофилы . В статье представлены основные протоколы для обработки дрозофилы клеточных линий. Она дополняет существующие ресурсы, чтобы помочь исследователей стать комфортно с обработкой дрозофилы клеточных культур и достичь уровня независимости в их экспериментов1,2,8,9 ,10.
Наиболее часто используемые линии клетки дрозофилы являются: Шнайдер линии11, Kc16712, Mitsubishi/Мияке имагинальных дисков и центральной нервной системы (ЦНС) линии13,14, Милнер Лаборатория имагинальных дисков линии 15,16,линии клеток взрослого яичников17и Ras линии18 (Таблица 1). Шнайдер и Kc167 линии являются общие универсальные клеточные линии для использования в биохимии, экспрессии рекомбинантных трансгенных генов и обратного генетического экраны. Mitsubishi/Мияке лаборатории (мл) линии были получены от личиночных имагинальных дисков или центральной нервной системы (ЦНС), и они были полезны для исследования связанных с нейросекрета, правилам транскрипции и обработки РНК. Милнер (CME) диск линии были важными для изучения сигнала. ФГС/OSS клеточных линий, производный от мутантов взрослых яичники остаются важным реагентов для изучения влияния некодирующих небольшой биологии РНК в клетки семенозачатка содержание и дифференцирования17,19. И наконец Ras линии являются уникальными, потому что эти клеточных линий, полученных эмбрионов, ectopically выражая онкогена ран. Они имеют transcriptional подпись мышечных клеток-предшественников и выражает активную piRNA машины20. Последние обзорных статей и глав книг охватывают применение этих популярных клеточных линий с более детали2,,3–9.
Все эти линии клетки может быть subcultured и заморожены. Есть небольшие, но важные различные требования к как каждой ячейки строки поддерживается и подготовлен для криоконсервации. Например различные клеточные линии требуют различных средств массовой информации и добавки (Таблица 1). Строки также различаются по поверхности присоединения свойства, морфологии (рис. 1 и рис. 2), генотип и удвоение времени (Таблица 2). Мы представляем основные протоколы и подчеркнуть уникальные различия для обработки различных широко используемых дрозофилы клеточных линий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дрозофилы клеточных культур являются первичной реагентов для высокой пропускной способности на основе ячеек экранов. Их использование также дополняет исследования in vivo генетических, предоставляя однородная популяция клеток для биохимии, быстрое тестирование трансгенных конструкций до впрыскивать в мух, клеточная биология, микроскопии и совсем недавно соматических клеток генетического манипуляции с геном редактирования1,2,3,8,9,10.
Жизнеспособность и восстановление замороженных клеток дрозофилы чувствительна к резким колебаниям даже при низких температурах. НАУЧНЫМ магазины замороженные клеточные линии в жидкой фазе N2 (-196 ° C) и перевозит их в сухого льда (-78.5 ° C). Замороженные ампулы, которые были перевезены в сухой лед не должны передаваться обратно в жидкость N2 или морозильник-80 ° C для хранения. Вместо этого замороженные клетки следует разморозить, заполнения на плотность высокой клеток как можно скорее по прибытии (протокол раздел 1) и культивированный по назначению (протокол раздел 3). Если линии клетки не используются непосредственно для экспериментов, ячейки, строки должны быть криоконсервированных (раздел 6 протокол) до тех пор, пока они готовы для использования.
Некоторые клеточных линий, таких как линии ML-BG2-c2 и ран нужно несколько дней, чтобы оправиться от последствий возрождаются из криоконсервированных государства. Значительное количество сотовой мусора сопровождает эти клеточные линии в первые несколько дней после оттаивания. Покинул спокойно, клетки будет восстановить и размножаться. Многие дрозофилы клеточных линий на НАУЧНЫМ были адаптированы к расти в м3 на базе СМИ22. Для клеточных линий, которые медленно, чтобы оправиться от последствий таяния использование кондиционерами СМИ может быть полезным. Кондиционерами СМИ вероятно содержит факторы роста, выделяется клетками в средствах массовой информации, которые могут способствовать восстановлению и пролиферации клеток после оттаивания.
Клеточных линий, как правило, следуют кривая стереотипных роста, состоящий из участка запаздывания, экспоненциальная фаза, фаза плато и фазы обострения. Многие дрозофилы клеточных линий размножаться в лаг фазы роста, когда они выращиваются на плотность от 1 x 10-6 и 1 x 107 кл/мл при 25 ° C. Важно, что клеточных линий пассированные таким образом, чтобы они находятся всегда в фазы экспоненциального роста.
Слияние культуры, выраженный в процентах, описывает рост площади поверхности, которая охватывается клеток. Слияния клеток для строки ячейки зависит от его клетки форму и размер. Различных клеточных линий имеют различные морфологии и присоединения свойства. В результате различных клеточных линий на приблизительно одинаковые слияния может иметь плотность значительно различных клеток (рис. 1). Слияние культуры не может быть идеальный показатель для пассированый дрозофилы клеточных культур, потому что дрозофилы клеточных линий продолжают распространяться либо путем укладки поверх друг друга как очагов или подвеска, даже после того, как был рост поверхности крытая (рис. 1). Однако пользователи опытных с конкретными клеточных линий может часто используют слияния как быстрым Путеводитель для когда для субкультуры.
Хотя это можно выращивать дрозофилы линии окружающего RT между 19−25 ° C, не рекомендуется, потому что колебания температуры окружающей среды может повлиять на скорость распространения. Рекомендуется использовать выделенный 25 ° C-инкубатора. Инкубатор для культур клеток дрозофилы не нужно облегчить обмен газа CO2 , потому что дрозофилы клетки культуры СМИ не используйте CO2 для буферизации. Влажность внутри инкубатора для культивирования клеток линии является важным фактором не следует упускать из виду при культивировании клеток в тарелках. В зависимости от типа инкубатора и рабочей среды может быть необходимо разместить стакан стерильной воды внутри инкубатора. Чтобы свести к минимуму испарения СМИ, использовать закрытые T-настой или хранить культуры пластин в плотно закрытом пластиковом контейнере внутри инкубатора.
Важно разработать график для subculturing дрозофила клеточных линий. Для оценки последовательности монитора и темпы роста, это удобно для субкультуры в даже геометрические пропорции (Сплит соотношение 1:2, 1:4, 1:8). Например 10 мл вырожденная плита Kc167 клеток в 8 х 106 клеток/мл может быть разделен на соотношение 1:8 для достижения посева плотность 1 х 106 клеток/мл (1,25 мл суспензии клеток, разбавляют в 8,75 мл свежего СМИ). В 72 h Kc167 культур, как ожидается, размножаться к плотности 8 х 106 клеток/мл, учитывая его удвоения время 24 ч. Коэффициент разделения таким образом определяется для облегчения удобный субкультура рутинной до два раза в неделю, обеспечивая, что клетки всегда культивировали в фазе роста их экспоненциальный журнала. Это позволяет для регулярного расписания для subculturing клетки, так что время слияния является слишком коротким и не слишком долго. Если время слияния является слишком коротким, клетки subcultured на более низкую плотность клеток (высокий коэффициент разделения). Аналогично Если время достичь слияния является слишком длинным, клетки subcultured на более высокую плотность клеток (Нижняя Сплит соотношение). Важно отметить, что большинство дрозофилы клеточных линий очень чувствительны к низкой сотовый плотности (< 1 х 105 клеток/мл), в котором клетки вряд ли размножаться и может в конечном итоге умрет.
Дрозофилы клеточных линий различаются характеристики роста и морфологии. В результате клеточных линий с различных свойств могут должны обрабатываться по-разному. Большинство линий клетки дрозофилы полу сторонником. На нижнем плотность клеток, они придерживаться сильнее поверхности роста и культуры становится вырожденная, клетки становятся менее сторонником и легко отсоединить. Это постепенное изменение в сотовый присоединению облегчает легко subculturing наиболее широко используемых дрозофилы клеточных линий (Шнайдер, Kc линий, имагинальных дисков и ЦНС линии), как это позволяет оператору просто обойтись СМИ над монослое клеток выбить их от роста поверхности при плотной культуры. Для линий, которые являются приверженцем поверхности, такие как женские зародышевой линии стволовых/яичников соматических оболочка (fGS/OSS) и Ras линии, важно для инкубации клеток в трипсина на короткий срок для помощи в отделение клетки с поверхности роста.
Средства массовой информации дополнения для большинства дрозофилы клеточных линий включают плода телячьей сыворотки (FCS). Инсулин и взрослых летать экстракт (ФЕКС) требуются для некоторых конкретных линий. ФЕКС содержит неопределенный компонентов необходимых для роста конкретных личиночных имагинальных дисков линий и линий клеток взрослого яичников. Готовит НАУЧНЫМ, и делает доступных взрослых ФЕКС производных от 1 неделя старый мух Орегон-R-modENCODE (RRID: BDSC_25211) в 2,5 мл и 10 мл аликвоты. НАУЧНЫМ также предоставляет инструкции для малого масштаба ФЕКС подготовку на своем веб-сайте . Подготовка ФЕКС, однако, много времени и требует большое количество взрослых мух.
Криоконсервирования клеточных линий дрозофилы экономит время и реагенты для поддержания клеточных линий не в немедленного использования. Криоконсервация достигается медленно замораживание клеток (-1 ° C/мин) до-80 ° C в среде, содержащей ДМСО, криозащитных агента. Медленное охлаждение шаг имеет решающее значение для успешного криоконсервирования. В морозильной камере-80 ° C ампулы клеток охлаждается в размере-1 ° C/мин при помещении в заморозки контейнера, заполненного изопропиловый спирт. Начиная с при окружающей температуре 25 ° C, он будет принимать до 2 ч для температуры в ампулах до-80 ° C. Рекомендуется оставить ампулы заморозить на ночь.
Замороженные ампулы должны быть быстро передано в жидкой фазы азота для длительного хранения. При температуре окружающего воздуха cryovial будет быстро разогреть примерно 10 ° C/мин и жизнеспособность будет ставиться на выше-50 ° C23. Чтобы сохранить быстрой передачи, обработки ампул в небольших партий для сведения к минимуму воздействия температуры окружающей среды. Кроме того, место замороженные криовалы на сухой лед при подготовке к их передачи в жидкость N2. Если жидкий азот не доступен, клетки могут храниться в морозильной камере-80 ° C, хотя с риском значительного ухудшения с течением времени.
Плотность клеток имеет решающее значение для успешного криоконсервирования и последующего возрождения клеточных линий. В целом новая ячейка, которую линии должны быть заморожены для создания первоначальной заморозить (1−3 ампулы) как только избыток клеток становится доступной. Как только линия клетки были далее культивировали стабильно, замороженные запас 10−20 ампулы должны быть созданы. Затем этот запас разморожен для проверки ее восстановления после заморозки клеток и жизнеспособности, после чего она распространяется для экспериментов или заменить акции, когда количество замороженных запасов ампулы падает ниже 5. Наконец важно проверить, что талой клетки сохраняют характеристики своих родителей акций как клеточные линии известны развиваться3,24.
В заключение эта статья представляет грунтовка для работы с дрозофилы клеточных культур путем предоставления основной информации о различных линий, наилучшей практики и аудиовизуальных протоколы для базовой обработки дрозофилы клеточных линий. Этот доступный ресурс предназначен для плавно облегчить введение в работу с культивируемых клеток дрозофилы и дополнить существующие учебные руководства любой исследовательской лаборатории.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим национальных институтов здравоохранения (низ P40OD010949 премия) и научно-исследовательское сообщество для использования различных ресурсов ДНК/вектор/клеток D. melanogaster , куратор на НАУЧНЫМ.
Materials
| 100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
| 25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
| 35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
| Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
| Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
| Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
| Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
| Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
| Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
| Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
| Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
| Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
| L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
| Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
| Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
| Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
| Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
| Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |
References
- Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).
- Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
- Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
- Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
- Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
- Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
- Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
- Echalier, G. . Drosophila Cells in Culture. , (1997).
- Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. . Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).
- Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. . Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
- Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
- Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
- Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
- Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
- Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
- Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
- Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
- Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).
- Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).
