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Developmental Biology

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/59459
, , ,
1Drosophila Genomics Resource Center, Department of Biology,Indiana University Bloomington

Summary

Drosophila -Zell-Linien sind wichtige Reagenzien für Grundlagen- und biomedizinische Forschung. Dieser Artikel enthält Protokolle für Auftauen, Inkubationsschale und die Kryokonservierung von häufig verwendeten Drosophila Zelllinien, Forscher bei der Einbeziehung der Verwendung dieser Reagenzien in ihrer Forschung zu unterstützen.

Abstract

Derzeit gibt es über 160 verschiedene Drosophila -Zelllinien von Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) verteilt. Mit Genom Engineering soll die Anzahl der neuartigen Zell-Linien zu erhöhen. Die DGRC soll Forscher damit vertraut, mit Drosophila Zelllinien als ein experimentelles Werkzeug zu ergänzen und ihre Forschungsagenda zu fahren. Verfahren für das Arbeiten mit einer Vielzahl von Drosophila -Zell-Linien mit unterschiedlichen Charakteristiken sind zur Verfügung gestellt, einschließlich der Protokolle für Auftauen, Kultivierung und cryopreserving Zell-Linien. Wichtig ist, zeigt diese Publikation die best Practices, die Arbeit mit Drosophila Zelllinien zur Minimierung des Risikos von Kontaminationen aus hinzutretender Mikroorganismen oder andere Zell-Linien. Forscher, die sich mit diesen Verfahren vertraut gemacht werden können, in vielen Anwendungen zu beschäftigen, die Drosophila kultivierten Zellen einschließlich der Biochemie, Zellbiologie und funktionelle Genomik verwenden.

Introduction

Die Verwendung von Drosophila kultivierten Zellen Ergänzungen in-vivo fliegen Genanalyse und dient als primäre Anfrage-Tool für den Umgang mit vielen biologischen Grundfragen1,2,3. Drosophila -Zell-Linien bieten einzigartige homogene Populationen von Zellen aus verschiedenen Gewebe Quellen mit unterschiedlichen genetischen Hintergrund. Zell-Linien eignen sich für viele Anwendungen einschließlich transgenen Genexpression, Genomik, Transkriptom, Proteomik, Metabolomik, Hochdurchsatz RNA-Interferenz (RNAi) Bildschirme, Zellbiologie und Mikroskopie. Wichtig ist, erleichtert die Verwendung von Drosophila Zellkultur die Charakterisierung der unmittelbaren zeitlichen Antworten auf bekannte Reize. Darüber hinaus ist Drosophila Zellkultur zugänglicher CRISPR-Cas9 Genom bearbeiten, so dass es relativ einfach, neue Zelllinien mit spezifischen Genom Änderungen4,5,6, 7.

Die Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) dient als Repository und Verteilung Zentrum für Drosophila -Zell-Linien. Eines der Ziele der DGRC soll Mitglieder der Forschungsgemeinschaft bei Drosophila Zelle Kultur Mitteln unterstützen. Dieser Artikel stellt grundlegende Protokolle für die Handhabung von Drosophila -Zell-Linien. Es ergänzt die vorhandene Ressourcen, um Forscher vertraut mit der Handhabung von Drosophila -Zellkulturen und ein Maß an Unabhängigkeit bei ihrer Experimente1,2,8,9 ,10.

Die am häufigsten verwendeten Drosophila -Zell-Linien sind: Schneider Linien11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginalen Scheibe und zentralen Nervensystems (ZNS) Zeilen13,14, Milner Labor imaginalen Scheibe Linien 15, die Erwachsenen Eierstock Zelle Linien16,17und Ras Linien18 (Tabelle 1). Die Schneider und Kc167 sind allgemeine Allzweck-Zell-Linien für den Einsatz in Biochemie, rekombinante transgenen Genexpression und reverse genetische Bildschirme. Die Mitsubishi/Miyake-Labor (ML)-Linien stammen aus der Larven imaginalen Scheiben oder zentrale Nervensystem (ZNS) und sie wurden nützlich für Studien im Zusammenhang mit Neurosecretion, Transkription und die RNA-Verarbeitung. Milner (CME) Scheibe Linien sind wichtig für das Studium der Signaltransduktion gewesen. Die fGS/OSS-Zelllinien aus mutierten Erwachsenen Eierstöcke bleiben wichtige Reagenzien zur Untersuchung der Auswirkungen von nicht-kodierenden kleine RNA Biology Keimzelle Wartungs- und Differenzierung17,19. Zu guter Letzt sind die Ras-Linien einzigartig da diese Zelllinien aus Embryonen, die mit dem ectopically Ausdruck der Ras-Onkogen. Sie haben die transkriptionelle Signatur von Muskel Vorläuferzellen und aktive PiRNA Maschinen20drückt. Den letzten Review-Artikel und Buchkapitel decken die Anwendungen dieser beliebten Zelllinien mit mehr Details2,3,9.

Diese Zelllinien können subkultiviert und eingefroren. Es gibt leichte, aber wichtige unterschiedliche Anforderungen für jede Zelllinie ist gepflegt und vorbereitet für die Kryokonservierung. Beispielsweise erfordern verschiedene Zelllinien verschiedener Medien und Ergänzungen (Tabelle 1). Die Linien unterscheiden sich auch in Einhaltung der Oberfläche Eigenschaften, Morphologien (Abbildung 1 und Abbildung 2), Genotyp und Verdopplungszeit (Tabelle 2). Wir präsentieren grundlegende Protokolle und die einzigartige Unterschiede für den Umgang mit verschiedenen weit verbreiteten Drosophila -Zell-Linien hervorheben.

Protocol

(1) Auftauen und die Wiederbelebung der gefrorenen Drosophila -Zell-Linien Sterilisieren Sie die Haube durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol. 5 mL des entsprechenden Mediums (Tabelle 1) in einem 25 cm-2 T-Flasche (t-25) zu verzichten. Entfernen Sie die Cryoröhrchen/Ampulle aus Flüssigkeit N2 oder Trockeneis. Wischen Sie die Cryoröhrchen mit 70 % Ethanol, vorsichtig lösen und Entsiegelung der Ampulle. Mit einer Pasteurpipette, 1 mL der Raumtemperatur (RT) Medien von der t-25 Kolben abziehen. Fügen Sie langsam die Medien in die Cryoröhrchen und vorsichtig mischen um tauen die gefrorenen Zellen, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension nicht überläuft. Übertragen Sie das gesamte Volumen der aufgetauten Zellsuspension aus der Ampulle in den t-25 Kolben. Wiederholen Sie, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension vollständig übertragen wurde. Legen Sie die Flasche in einem Inkubator 25 ° C, so dass die Zellen, sich niederzulassen und halten für mindestens 2 h untersuchen die Zellen unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass die meisten Zellen auf die wachsende Oberfläche angesiedelt haben. Sanft entfernen Sie alte Medien und mit 5 mL frischem Medien ersetzen. Rückkehr der Küvette in den Brutkasten. Am folgenden Tag sanft entfernen Sie die alten Medien und mit 5 mL frischem Medien ersetzen. Die Kultur in den Inkubator zurück. (2) Auftauen und die Wiederbelebung der gefrorenen Drosophila -Zell-Linien (Alternative) In einem sterilen Haube Auftauen der Zellen durch das gefrorene Pellet mit 1 mL RT Medien resuspending. Übertragen Sie die aufgetaute Zellsuspension in eine 15 mL konische Rohr. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 X g für 5 min. verwerfen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL frische Medien. Das gesamte Volumen der Zellsuspension in einem t-25 Kolben übertragen und die Kultur bei 25 ° c inkubieren 1 bis 2 h später, untersuchen die Zellen unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass die meisten Zellen auf die wachsende Oberfläche angesiedelt haben. Am Folgetag ersetzen die alten Medien mit 5 mL frischem Medien und zurück die Kultur in den Inkubator. 3. Subkultivieren semi-adhärente Zellen gewachsen in 100 mm-Kultur-Platten Sterilisieren Sie die Haube durch Abwischen mit 70 % Ethanol. Bringen Sie das Sterilgut für Inkubationsschale in der Haube, einschließlich Medien Flaschen, Pipetten, Pipette Hilfe und Kultur Platten. Untersuchen Sie die Morphologie und Zusammenfluss der Kultur unter dem Mikroskop. Suchen Sie nach deutliche Anzeichen von Oxigenierung Kontaminationen in der Kultur. Bestimmen, ob die Zellen passagiert werden, bereit sind, anhand der Merkmale der Kultur: Zelle Dichte und Verdopplungszeit, einschließlich das letzte Mal waren sie subkultiviert. Wenn die Kultur hoch erscheint Zusammenfluss (Abbildung 1), bestimmen die Zelldichte. Verdrängen Sie in der sterilen Haube die Zellen von der Oberfläche wachsenden Pipettieren bis 10 mL des Mediums von der Platte und es über die Zellen. Wiederholen Sie ein paar Mal, nicht um Schaum zu erstellen, bis klar, die wachsende Oberfläche wird zu gewährleisten. Bestimmen Sie die Zelldichte über eine Hemocytometer oder eine automatische Partikelzähler (Abschnitt 5, Abbildung 3). Subkultur der Zellen ist die Zelldichte von 5 x 106 bis 1 x 107 Zellen/mL.Hinweis: Tun Sie nicht Subkultur Drosophila Zelllinien zu einer Zelle Dichte unterhalb von 1 x 106 Zellen/mL. Die Zellsuspension mit entsprechend ein geeignete Medium, um eine Aussaat Endkonzentration von mindestens 1 x 106 Zellen/mL zu verdünnen. Fügen Sie für routinemäßige Passagierung und Wartung eine entsprechende Volumen der Zellsuspension zu einem vorher festgelegten Volumen des Mediums in eine neue Kultur-Platte auf die gewünschte Zelle Aussaatdichte zu erreichen. Übertragen Sie für die Aufstockung einer Kulturkreis die Zellsuspension in eine große Flasche. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf die gewünschte Zelle Dichte mit einem entsprechenden Volumen des Mediums. Gleiche Volumina von verdünnter Zellsuspension zu neuen Platten zu verteilen. Diese Methode minimiert die Variationen in der Zelle Dichte zwischen den Platten. Decken Sie und beschriften Sie die Platten mit den Betreiber Initialen, Datum, Split-Verhältnis, Aussaatdichte Zelle, Zelle Zeile Bezeichner, Medien, Passagenanzahl und Medien Zusätze wie Antibiotika. Legen Sie die Platten in einem Plastikbehälter und Rückkehr der Box in den Inkubator.Hinweis: Tabelle 3 listet die Kulturgefäße allgemein verwendet für die Kultivierung von Drosophila -Zell-Linien und der damit verbundenen Arbeitsvolumen. (4) verdrängen adhärente Zellen gewachsen in 100 mm-Kultur-Platten Übertragen Sie das Medium von der Platte auf eine neue sterile Flasche. Das Medium zu speichern. Spülen Sie Zellen durch Zugabe von 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA langsam bis auf den Teller. Schwenken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Trypsin-Lösung umfasst die gesamte Wachstumsoberfläche. Die Trypsin-Lösung zu verwerfen. Fügen Sie sanft 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA an der Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 25 ° C zwischen 3−10 min während monitoring für sichtbare Zeichen der Zelle Schicht abnehmen und Schiebe die wachsende Oberfläche deaktiviert. Die Platte Trypsin Aktivität stoppen fügen Sie 9 mL des gespeicherten Mediums hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension um Zelle Klumpen zu distanzieren. Sobald alle Zellen verdrängt wurde, wird die wachsende Oberfläche klar sein.Hinweis: Die Verwendung von Verdauungs-Enzymen wie Trypsin Aids in Passagierung stark adhärenten Zelllinien. Trypsin ist eine Mischung von Proteasen, die oft von porcinen Bauchspeicheldrüse abgeleitet und ist im Handel erhältlich in verschiedenen Qualitäten der Reinheit. 5. manuelle Zellzählung mit Neubauer Zelle zählen Folie Bereiten Sie die Hemocytometer Folie und Deckglas durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Alkohol. Mischen Sie die Zellsuspension und verzichten Sie 15 µL Zellsuspension zu, in den geriffelten Rand des Hemocytometer (Abbildung 3A), die erste Kammer des die Hemocytometer zu füllen. Die zweite Kammer des die Hemocytometer zu füllen. Durch Kapillarwirkung wird die Zellsuspension in der Zählkammer gezogen werden. Mit einem 10-fach Mikroskopobjektiv, zählen Sie die Zellen innerhalb der 1 mm-2 -Gebiet in der Mitte des Rasters durch die parallelen Linien (Abbildung 3,D) gebunden. Zur Vermeidung einer doppelten Erfassung, zählen Sie die Zellen, die oberen und linken Grenzen zu überlagern, aber keine Zellen, die den rechten und unteren der 200 µm2 Plätze Grenzen. Zwischen den 100−200 Zellen zu zählen. Wiederholen Sie die Anzahl die mit der zweiten Kammer. Berechnen Sie den Mittelwert der beiden Grafen und bestimmen die Zelldichte nach folgender Formel: Handy-Dichte (Zellen/mL) durchschnittliche Zellzahl (n-1 + n22) x 10 =4.Hinweis: Zellviabilität wird als Prozentsatz der lebensfähigen Zellen über insgesamt Zellen ausgedrückt. Ermitteln der Zellviabilität mischen Sie die Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypan blau (0,4 %) Lösung vor manuelle oder automatische Zellzählung. Lebenden Zellen werden der Farbstoff nicht aufnehmen, während abgestorbene Zellen blau gefärbt werden. 6. die Kryokonservierung von Drosophila -Zell-Linien Überprüfen Sie die Kultur für gesunde Morphologie, Wachstum und der Mangel an Verunreinigung. Ernte der Kulturen aus der Mitte zu spät-Log Wachstumsphase (Schritt 3.3 oder Abschnitt 4). Für viele Drosophila -Zell-Linien ist es etwa zwischen 4 x 106 Zellen/mL bis 8 x 106 Zellen/mL. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in eine 15 mL oder 50 mL konische Rohr. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 X g für 5 min und verwerfen Sie den überstand. Aufschwemmen der Zelle Pellet in einem Volumen von freezing Medium (Tabelle 4), die eine endgültige Zelldichte von mindestens 4 x 107 Zellen/mL ergeben. Fügen Sie tropfenweise die entsprechende Menge an Kryoprotektivum Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in die Zellsuspension derart, dass die letztendliche DMSO-Konzentration 10 %. Mischen Sie vorsichtig die Zellsuspension. Sorgfältig zu 0,5 mL Zellsuspension in Aliquote bereits beschriftete Cryovials (~ 2 x 107 Zellen/Vial) verzichten. Legen Sie die Ampullen in einen eiskalten Behälter gefüllt mit Isopropanol (Abb. 4A). Übertragen den eiskalten Container in einem-80 ° C Gefrierschrank über Nacht damit die Temperatur des Cryovials langsam fallen (-1 ° C/min) auf die Gefrierschrank-Temperatur. Die gefrorenen Cryovials herausnehmen und schnell Stöcke (Abbildung 4 b) beifügen. Setzen Sie die Stöcke mit Cryovials in einem Kanister (Abbildung 4). Alternativ legen Sie gefrorene Cryovials in einem vorgekühlten Einfrieren Karton (Abbildung 4). Shop Cryovials in der flüssigen Phase der N2 Gefrierschränke (Abbildung 4E,F) eingefroren.Hinweis: Bei der Verwendung von eisigen Medien mit DMSO ist eine Verzögerung von bis zu 30 min bei RT nicht schädlich für die Zellen.

Representative Results

Es ist wichtig, gefrorene Drosophila Zellen schnell auftauen und Kultur sie in einer Zelle Dichte, die die Kultur in der Wachstumsphase zurückbringt. Wenn die Verfahren für die Kryokonservierung und Auftauen eingehalten werden, wird die Zelldichte in der t-25 Kolben mindestens 4 x 106 Zellen/mL gleich. Ein bis zwei Stunden nach dem Auftauen beginnt die meisten Drosophila -Zell-Linien auf die wachsende Oberfläche befestigen. Unter dem Umstand, in dem meisten Zellen nicht auf die wachsende Oberfläche innerhalb von zwei Stunden nach dem Auftauen angeschlossen haben, empfiehlt es sich, die Zellen Inkubation über Nacht vor dem Wechsel der Medien. Das Ziel des Inkubationsschale soll Zellen in der gesunden exponentielle Log-Phase die Wachstumskurve zu pflegen. Die Kriterien für die Inkubationsschale richten sich nach den sichtbaren Mangel Oxigenierung Kontamination, Zelldichte und die Notwendigkeit eine regelmäßigen Wartungsplan. Es ist wichtig, zuerst die Gesundheit der Zellen zu beurteilen und fehlender zufällige Verunreinigungen vor dem Einfrieren zu bestimmen. Die meisten bakteriellen und pilzlichen Schadstoffe sind leicht zu erkennen durch visuelle Kontrollen. Kontaminierten Kulturen können durch eine Erhöhung der Medien Trübung identifiziert werden. Unter dem Mikroskop erscheinen Verunreinigungen als bakterielle Stäbchen, Kokken, angehende Hefezellen oder String-wie pilzliche Hyphen. Andere Quellen von Verunreinigungen wie z. B. die nicht zytopathischen Mykoplasmen nicht visuell erkannt werden und können durch PCR-basierten Tests21routinemäßig getestet werden. Zusammenfluss von einer Zelllinie visuell ermittelt werden (Abbildung 1). Schnell wachsende Zelllinien Zusammenfluss früh erreichen und müssen regelmäßig passagiert. Solche Linien sind bis zu zweimal wöchentlich subkultiviert. Im Gegensatz dazu sind langsamere wachsende Zellen passagiert mindestens einmal alle zwei Wochen oder länger. Die Zellen müssen jedoch frische Medien wöchentlich gefüttert werden. Dies ist um Medien Erschöpfung zu verhindern und Abfallprodukte des Stoffwechsels von den Zellen zu verdünnen. Zell-Linien aus unterschiedlichen Gewebe Quellen unterscheiden sich in ihrer Morphologie (Abbildung 2), Einhaltung der Eigenschaften Medienanforderungen (Tabelle 1) und Verdopplungszeit (Tabelle 2) abgeleitet. Tabelle 5, Tabelle 6, Tabelle 7und Tabelle 8 Liste der Rezepte für die verschiedenen Drosophila Zellkulturmedien. Zellzählung sorgt für eine präzise Aussaatdichte und eine vorhersehbare Routine für Inkubationsschale. Für quantitative Experimente ist die Zellzählung unerlässlich. Zellen sind entweder mit einem Hemocytometer (Abbildung 3A) oder eine automatisierte Partikelzähler (Abb. 3 b) gezählt. Wenn einen automatische Zähler zu verwenden, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Zählen Zellen manuell ist mit einem Hemocytometer, sparsam und einfach. Die Anzahl der Zellen in der mittleren Neubauer Gitter umschlossen werden gezählt und die Zelldichte berechnet; Zum Beispiel, n = 214 Zellen, was zu einer Zelldichte von 2,14 x 106 Zellen/mL (Abbildung 3D). Zellsuspension aus zwei 100 mm Platten, jeweils mit 10 mL Zellsuspension bei 4 x 106 Zellen/mL gesammelt und Nukleinsäuretablette in 2 mL des Einfrierens Medien, eine Dichte von 4 x 107 Zellen/mL zu erreichen. 2 x 107 Zellen enthält jedes gefrorene Cryoröhrchen mit 0,5 mL Zellsuspension. Dies führt zu einer Kultur mit 4 x 106 Zellen/mL wenn gemäß dem Protokoll Abschnitt 1 aufgetaut. Abbildung 1 : Repräsentative Bilder von drei unterschiedlichen Drosophila bei verschiedenen Confluence und Zelle dichten Zellinien. (A) S2-DGRC Kultur bei 1 x 106 Zellen/mL. (A’) S2-DGRC Kultur bei 4,5 x 106 Zellen/mL. (B) ML-BG2-c2 Kultur bei 2 x 106 Zellen/mL. (B’) ML-BG2-c2 Kultur bei 8 x 106 Zellen/mL in die Zellen häufen und Aggregation als Brennpunkte. (C) OSS Kultur bei 1 x 106 Zellen/mL. (C’) OSS-Kultur bei 4 x 106 Zellen/mL. Zellen in der Suspension werden nicht auf der gleichen Brennebene erfasst. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.  Abbildung 2 : Repräsentative Bilder der acht unterschiedlichen Drosophila Zelllinien. (A) Round Embryo-S2-DGRC abgeleitet. (B) Runde Embryo abgeleitete Kc167. (C) Runde Larven CNS abgeleitet ML-BG2-c2. (D) Runde Larven spindelförmige ML-BG3-c2. (E) CME L1, einer Zelllinie, abgeleitet von den Larven Bein imaginalen Disks ist kleiner und hat Runde/fusiformis Morphologie. (F) OSS, eine Zell-Linie abgeleitet von Erwachsenen Eierstöcke zeigt spindelförmige Morphologie. (G) spindelförmig RasV12 -Zell-Linie mit dem Ausdruck aktiviert Ras. (H) RasV12; WtsRNAi (WRR1), eine Zell-Linie mit dem Ausdruck aktivierte Ras und doppelsträngige RNA targeting Tumorsuppressor Warzen (Wts), epithelialen Merkmale angezeigt. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Zelldichte kann gezählt werden, manuell mit Hilfe eines Hemocytometer oder automatisch über eine automatisierte Partikelzähler. (A) A Hemocytometer mit zwei Kammern. (B) eine automatisierte Zelle Zähler zur Darstellung der Ausgabe einer Zellzahl. (C) der verbesserten Neubauer Zellzählung Raster unter einem 10 X-Objektiv betrachtet. Anzahl Zellen von 0,1 mm3 zentralen Gitter (rote gestrichelte Linie Quadrat) gebunden. (D) voller Zellen für die Zählung der zentrale Gitter auf der Hemocytometer. Maßstabsleiste = 1 mm (C); 0,2 mm (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Ausrüstung für die Kryokonservierung. (A) A Einfrieren Container speichert die Ampullen in einer aufrechten Position für das langsame Einfrieren. (B) ein Metall Zuckerrohr für die Abhaltung von gefrorenen Ampullen. (C) A Kanister für die Abhaltung der Stöcke. (D) ein Einfrieren Kunststoffbox (Cryobox). (E) ein Kanister hält mehrere Stöcke in einem Lagertank Flüssigkeit N2 eingefügt. (F) eine Flüssigkeit N2 Vorratsbehälter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Zelle Stamm Medien Einhaltung der Trypsin Schneider-Linien M3 + BPYE + 10 % fetalen Kälberserum (FCS), pH 6,6 Semi-Anhänger Nein (S2R + S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11 Schneiders Media+ + 10 % FCS KC Linien (Kc167, Kc7E10)21,22 M3 + BPYE + 5 % FCS, pH 6,6 Semi-Anhänger Nein Hyclone-CCM3, pH 6,2 Imaginale Scheibe und CNS (ML-Linien)13,14 M3 + BPYE + 10 % FCS, pH 6,6 Semi-Anhänger Nein 10 µg/mL insulin Milner imaginalen Scheibe Linien (CME-Linien)15 M3 + 2 % FCS Semi-Anhänger Nein 5 µg/mL insulin 2,5 % fliegen Extrakt fGS/OSS16 M3 + 10 % FCS, pH 6,8 Anhänger * 10 µg/mL insulin 1 mg/mL C5H8KNO4   0,5 mg/mL KHCO3  0,6 mg/mL Glutathion 10 % fliegen Extrakt RASV12 Linien18 M3 + BPYE + 10 % FCS, pH 6,6 Anhänger Ja Tabelle 1: Die Eigenschaften und Medien Anforderungen verschiedener Drosophila Zellinien. Verschiedenen Isolaten von semi-adhärente Schneider Linien einschließlich S2R + S2-Drosophila RNAi Screening-Zentrum (DRSC), S2-Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) und Sg4 sind häufig verwendeten Zelllinien, die robust vermehren, wenn in M3 Medien kultiviert + Bactopetone Hefeextrakt (BPYE) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS) ergänzt. Alternativ ist Schneiders Medien (pH 6,7-6,8) oft an Stelle von M3 + BPYE verwendet. Die Kc-Linien vermehren sich in entweder M3 + BPYE (5 % FCS) oder serumfreien CCM3 Medien. ML imaginalen Scheibe und zentralen Nervensystems (ZNS) Linien benötigen Insulin-Supplementierung für Verbreitung. Die Milner imaginalen Disc Leitungen erfordern, dass Insulin und Fliege Supplementierung extrahieren. Anhaftende fGS/OSS Zelllinien benötigen Insulin, eine höhere Konzentration von Fly-Extrakt sowie Glutathion für Wachstum. Anhaftende RasV12 Linien wachsen gut in M3 + BPYE (10 % FCS). Trypsin wird verwendet, um adhärente Zell-Linien aus der Wachstumsoberfläche zu verdrängen. Zelllinie (# auf Lager) Genotyp Verdopplungszeit (h) * Gewebe-Quelle S2R + (150) OreR 39 Späten Embryonen S2-DGRC (6) OreR 23 Späten Embryonen S2-DRSC (181) OreR 46 Späten Embryonen Kc167 (1) e/se 22 6−12 h Embryonen ML-BG2-c2 (53) y v f mal 48 3rd Instar Larven CNS ML-BG3-c2 (68) y v f mal 104 3rd Instar Larven CNS ML-DmD8 (92) y v f mal 66 3rd Instar Larven Flügel disc CME W1 Cl.8+ (151) OreR 46 3rd Instar Larven Flügel disc CME-L1 (156) OreR 47 3rd Instar Larven Bein disc OSS (190) BamD86 45 Erwachsenen Bam mutierten Eierstöcke RAS-V12 -Linien FH-GFP; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 41−65 Embryo Tabelle 2: Genotyp, Verdoppelung der Zeit, und Gewebe Quellen von allgemein verwendet Drosophila Zellinien. Die Gewebe-Genotyp, Quelle und Bevölkerung Verdopplungszeit von häufig verwendeten Zelllinien werden vorgestellt. Verdopplungszeit basiert auf Wachstum in den empfohlenen Medien bei 25 ° C. Kulturgefäß Volumen von Medien (mL) 12,5 cm2 T-Kolben 2.5 25 cm2 T-Kolben 5 75 cm2 T-Kolben 15 35 mm Platte 1 60 mm Platte 4 100 mm Platte 10 384-Well-Platte * 0,04/Brunnen 96-Well-Platte * 0,1/Brunnen 48-Well-Platte * 0,3/Brunnen 24-Well-Platte * 0,5/Brunnen 12-Well-Platte 1.0/Brunnen 6-Well-Platte 2.0/Brunnen Tabelle 3: Kultur-Schiffe und die empfohlenen Medien Bände. Kulturgefäße in verschiedenen Größen stehen zur Verfügung für die Kultivierung von Drosophila Zellen. Für jedes Schiff werden die entsprechenden Medien-Volumen (mL) empfohlen. Versiegeln Sie Multi-well-Platten mit weniger als 0,5 mL Zellsuspension mit Paraffin Film Medien Verlust durch Verdunstung zu verringern. Volumen M3 + BPYE, pH 6,6 70 mL Hitze inaktiviert FCS 20 mL Sterile gefiltertes DMSO * 10 mL Tabelle 4: Rezept für die Zubereitung von 100 mL Einfrieren Medium (M3 + BPYE, 20 % FCS, 10 % DMSO). Bereiten Sie einfrierende Medien, je nach Bedarf und vermeiden Sie einfrierende Medien mit DMSO für längere Lagerung. M3 + BPYE medium Betrag Schilde und Sang die M323 1 Flasche KHCO3 0,5 g Wählen Sie Hefeextrakt 1,0 g Bactopeptone 2,5 g Sterile gereinigtes Wasser 1000 mL Tabelle 5: Rezept für die Zubereitung von 1 L M3 + BPYE Gewebe Kulturmedium. PH bis 6.6 anpassen. Sterilisieren Sie durch das Medium durch einen 0,22 µm Filter übergeben. Basis M3 Medium für fGS/OSS-Zell-Linie Betrag Schilde und Sang M3 1 Flasche KHCO3 0,5 g C5H8KNO4   1,0 g Sterile gereinigtes Wasser 1.000 mL Tabelle 6: Rezept für 1 L des fGS/OSS M3 Basis Medium. PH-Wert auf 6,8 einstellen. Sterilisieren Sie durch das Medium durch einen 0,22 µm Filter übergeben. Hyclone CCM3 Betrag CCM3 Pulver 28,6 g Nahco33 0,35 g 10 N NaOH 2,5 mL CaCl2 0,5 g Sterile gereinigtes Wasser 1.000 mL Tabelle 7: Rezept für 1 L Hyclone CCM3 Gewebe Kulturmedium. PH bis 6.2 anpassen. Sterilisieren Sie durch das Medium durch einen 0,22 µm Filter übergeben. M3 + BPYE + 10 % FCS Miyake Scheibe und CNS Linien medium Milner Scheibe Linien medium fGS/OSS komplette medium M3 + BPYE, pH 6,6 90 mL 90 mL – – Hitze inaktiviert FCS * 10 mL 10 mL 2 mL 10 mL Insulin (10 mg/mL) – 100 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Fliegen-Extrakt – – 2,5 mL 10 mL Glutathion (60 mg/mL) – – 1 mL M3, pH 6,6 – – 97,5 mL – fGS/OSS M3, pH 6,8 – – 79 mL Tabelle 8: Rezept für die Zubereitung von verschiedenen gemeinsamen 100 mL Drosophila Zellkulturmedien. Inkubieren Sie FCS bei 56 ° C 1 h und rütteln Sie alle fünf Minuten, um Hitze zu inaktivieren-Ergänzungs-Proteine.

Discussion

Drosophila -Zellkulturen sind primäre Reagenzien für hohen Durchsatz zellbasierte Bildschirme. Ihre Verwendung ergänzt auch in-vivo Genforschung durch eine homogene Population von Zellen geeignet für Biochemie, schnelle transgene Konstrukte vor dem Einspritzen in fliegen, Zellbiologie, Mikroskopie und jüngerer somatischer Zellen genetische Tests Manipulationen durch Genom Bearbeitung1,2,3,8,9,10.

Die Lebensfähigkeit und die Wiederherstellung der gefrorenen Drosophila Zellen reagiert empfindlich auf drastischen Schwankungen auch bei niedrigen Temperaturen. Die DGRC gefrorenen Zelllinien in der flüssigen Phase von N2 (-196 ° C) speichert und transportiert sie in Trockeneis (-78,50 ° C). Gefrorene Ampullen, die in Trockeneis transportiert wurden dürfen nicht wieder in Flüssigkeit N2 oder einem-80 ° C Gefrierschrank zur Aufbewahrung übertragen werden. Stattdessen sollte die gefrorenen Zellen aufgetaut, Platzierungsspiele auf eine hohe Zelldichte so bald wie möglich bei der Ankunft (Protokoll Abschnitt 1) und für den vorgesehenen Zweck (Protokoll Abschnitt 3) kultiviert werden. Wenn die Zelllinien nicht sofort für Experimente verwendet werden, kryokonserviert die Zelle, die Linien sollten (Protokoll siehe Abschnitt 6) bis sie betriebsbereit sind.

Einige Zelllinien, wie z. B. die ML-BG2-c2 und Ras Linien benötigen mehrere Tage, um von den Auswirkungen der aus dem kryokonservierten Zustand wieder erholen. Eine erhebliche Menge an Zelltrümmer begleitet diesen Zelllinien die ersten paar Tage nach dem Auftauen. Links ungestört, werden die Zellen erholen und sich vermehren. Viele Drosophila -Zell-Linien an den DGRC wurden in M3 basierend Medien22wachsen angepasst. Für Zell-Linien, die nur von den Auswirkungen langsam der Auftauen erholen, kann die Verwendung von konditionierten Medien hilfreich sein. Wahrscheinlich bedingte Medien enthalten Wachstumsfaktoren abgesondert von den Zellen in den Medien, die Förderung der Erholung und Proliferation der Zellen nach dem Auftauen können.

Zell-Linien folgen in der Regel eine stereotype Wachstumskurve, bestehend aus einem Lag-Phase, exponentielle Phase, Plateau-Phase und eine Verschlechterung-Phase. Viele Zell-Linien von Drosophila vermehren sich in der Log-Phase des Wachstums, wenn sie bei einer Dichte von 1 x 106 bis 1 x 107 Zellen/mL bei 25 ° c kultiviert werden Es ist wichtig, dass Zelllinien passagiert sind, so dass sie sich immer in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.

Zusammenfluss von einer Kultur, ausgedrückt als Prozentsatz, beschreibt die Wachstum Fläche, die durch Zellen bedeckt ist. Zusammenfluss der Zelle für eine Zelllinie hängt von seiner Zelle Form und Größe. Verschiedene Zelllinien haben unterschiedliche Morphologien und Einhaltung der Eigenschaften. Demzufolge möglicherweise verschiedene Zelllinien an ungefähr ähnlichen Mündung stark ausgeprägte Zelldichte (Abbildung 1). Kultur-Zusammenfluss möglicherweise kein idealer Indikator für Drosophila Zellkulturen Passagierung, weil Drosophila -Zell-Linien vermehren sich weiterhin entweder durch Stapeln übereinander als Brennpunkte oder in der Schwebe, auch nach der Wachstumsoberfläche abgedeckt (Abbildung 1). Jedoch können Benutzer mit bestimmten Zelllinien erfahren Zusammenfluss oft als eine schnelle visuelle Anleitung für wenn die Subkultur nutzen.

Es ist, zwar möglich, Drosophila Linien bei ambient RT 19−25 ° C zu wachsen ist es nicht empfohlen, da Schwankungen der Umgebungstemperatur die Proliferationsrate auswirken können. Eine dedizierte 25 ° C Inkubator wird empfohlen. Der Inkubator für Drosophila Zellkulturen muss nicht CO2 Gasaustausch zu erleichtern, weil Drosophila Zellkulturmedien CO2 nicht für die Pufferung verwenden. Die Luftfeuchtigkeit in die Brutmaschine für die Kultivierung von Zell-Linien ist ein wichtiger Faktor, nicht übersehen werden, wenn Zellen in Platten zu züchten. Je nach Art am Inkubator und das Arbeitsumfeld ist die legen Sie eines Bechers mit sterilem Wasser in die Brutmaschine erforderlich. Um Medien Verdunstung zu minimieren, verwenden Sie geschlossene T-Kolben oder speichern Sie Kultur Platten in einem dicht verschlossenen Plastikbehälter während in die Brutmaschine zu.

Es ist wichtig, einen Zeitplan für Subkultivieren Drosophila -Zell-Linien zu entwickeln. Um das Wachstum Rate und Monitor Konsistenz abschätzen zu können, ist es zweckmäßig, Subkultur zu einem noch geometrische Verhältnis (split-Verhältnis 1:2, 1:4, 1:8). Beispielsweise kann eine 10 mL konfluierende Platte von Kc167 Zellen bei 8 x 106 Zellen/mL im Verhältnis 1:8 zu Aussaatdichte von 1 x 106 Zellen/mL (1,25 mL Zellsuspension verdünnt in 8,75 mL frische Medien) aufgeteilt werden. In 72 h sollen Kc167 Kulturen zu einer Dichte von 8 x 106 Zellen/mL, vermehren sich angesichts seiner Verdopplungszeit von 24 h. Das Split-Verhältnis ist deshalb entschlossen, ermöglichen eine bequeme Subkultur Routine bis zu zweimal pro Woche, um sicherzustellen, dass die Zellen immer in ihre exponentielle Log Wachstumsphase kultiviert werden. Dies ermöglicht einen regelmäßigen Zeitplan für Subkultivieren der Zellen, so dass die Zeit zum Zusammenfluss weder zu kurz noch zu lang ist. Wenn die Zeit zum Zusammenfluss zu kurz ist, werden die Zellen bei einer niedrigeren Zelldichte (höhere Split-Verhältnis) subkultiviert. Ebenso, wenn die Zeit zum Zusammenfluss erreichen zu lang ist, sind die Zellen auf eine höhere Zelldichte (untere Split-Verhältnis) subkultiviert. Es ist wichtig zu beachten, dass die meisten Drosophila -Zell-Linien sehr empfindlich auf geringe Zelldichten sind (< 1 x 105 Zellen/mL), in welchen Zellen kaum vermehren und können schließlich sterben.

Drosophila -Zelllinien variieren in Wuchsmerkmalen und Morphologie. Infolgedessen müssen Zelllinien mit unterschiedlichen Eigenschaften unterschiedlich behandelt werden. Die meisten Drosophila -Zell-Linien sind semi-Anhänger. Bei geringer Zelldichte sie stärker an der Wachstumsoberfläche haften und wie die Kultur konfluierende wird, die Zellen werden weniger Anhänger und leicht lösen. Dieser allmähliche Veränderung in der Zelle Haftfähigkeit erleichtert einfach Inkubationsschale am häufigsten verwendete Drosophila -Zell-Linien (Schneider, Kc, Imaginale Scheibe und CNS-Linien), wie es der Bediener einfach Medien über die Zelle Monolage, sie verdrängen verzichten kann von der Wachstumsoberfläche, wenn die Kultur dicht ist. Für Linien, die Oberfläche Anhänger wie unbedingt die weiblichen Keimbahn Stamm/Eierstöcke somatischen Hülle (fGS/OSS) und Ras Linien, Zellen in Trypsin für eine kurze Dauer zu helfen, lösen die Zellen von der Wachstumsoberfläche auszubrüten.

Medien sind für die meisten Drosophila -Zell-Linien fetalen Kälberserum (FCS). Insulin und Erwachsenen fliegen Extrakt (FEX) sind für einige bestimmten Zeilen erforderlich. FEX enthält nicht definierte Komponenten wesentlich für das Wachstum von bestimmten Larven imaginalen Scheibe Linien und die Erwachsenen Eierstock Zelllinien. Die DGRC bereitet, und macht zur Verfügung Erwachsene FEX abgeleitet von 1 Woche alt Oregon-R-ModENCODE fliegen (RRID: BDSC_25211) in 2,5 mL und 10 mL Aliquote. Die DGRC enthält Anweisungen zum kleinen FEX Vorbereitung auch auf seiner Website . FEX Vorbereitung, jedoch ist zeitaufwändig und erfordert eine große Menge von Erwachsenen fliegen.

Die Kryokonservierung von Drosophila Zelllinien spart Zeit und Reagenzien für die Wartung von Zelllinien nicht in unmittelbaren Gebrauch. Die Kryokonservierung wird durch langsam Einfrieren der Zellen (-1 ° C/min) bis-80 ° C in DMSO, ein Cryoprotective-Agent-haltigem Medium erreicht. Die langsame kühle Schritt ist entscheidend für erfolgreiche Kryokonservierung. In einer Gefriertruhe-80 ° C wird die Ampulle von Zellen mit einer Rate von-1 ° C/min beim Platzieren in einem eiskalten Behälter gefüllt mit Isopropanol gekühlt. Ab 25 ° C Umgebungstemperatur, dauert es bis zu 2 h für die Temperatur in den Ampullen bis-80 ° c erreichen. Es wird empfohlen, die Ampullen über Nacht gefrieren lassen.

Gefrorene Ampullen müssen dann rasch in die flüssige Phase von Stickstoff für längere Lagerung transportiert werden. Bei Raumtemperatur die Cryoröhrchen wird bei etwa 10 ° C/min schnell erhitzen und die Lebensfähigkeit bei über 50 ° C23beeinträchtigt wird. Um die Übertragung zu schnellen halten, handhaben Sie Ampullen in kleinen Chargen, die Umgebungstemperatur minimieren. Alternativ legen Sie die gefrorenen Cryovials auf Trockeneis während der Vorbereitung für ihren Transfer in die Flüssigkeit N2. Wenn flüssiger Stickstoff nicht verfügbar ist, können die Zellen in einem-80 ° C Gefrierschrank, obwohl mit einem Risiko für eine signifikante Verschlechterung im Laufe der Zeit gespeichert werden.

Zelldichte ist entscheidend für erfolgreiche Kryokonservierung und die anschließende Wiederbelebung der Zell-Linien. In der Regel neue Zelle, die Linien eingefroren werden sollten, um die anfängliche erstellen Einfrieren (1−3 Ampullen), sobald ein Übermaß an Zellen zur Verfügung steht. Sobald die Zellinie stabil weiter kultiviert wurde, sollte ein gefrorenen bestand von 10−20 Ampullen erstellt werden. Dieser Bestand ist dann zu prüfen, ob seine Post-Freeze Zelle Erholung und Lebensfähigkeit, wonach es für Experimente propagiert wird oder die Aktie zu ersetzen, wenn die Anzahl der gefrorenen Lager Ampullen fünf unterschreitet aufgetaut. Zu guter Letzt ist es wichtig zu überprüfen, ob die aufgetauten Zellen die Eigenschaften seiner Eltern Aktien behalten, wie Zell-Linien bekannt sind,3,24zu entwickeln.

Dieser Artikel stellt abschließend eine Grundierung für die Arbeit mit Drosophila Zellkulturen durch die grundlegende Information über die verschiedenen Linien, best Practices und audiovisuellen Protokolle für die grundlegende Bedienung des Drosophila -Zell-Linien. Diese zugängliche Ressource soll, die Einführung in das Arbeiten mit kultivierten Zellen Drosophila reibungslos zu erleichtern und bestehende Trainingsanleitungen auf jedem Forschungslabor zu ergänzen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem National Institutes of Health (NIH-P40OD010949 Award) und der Forschungsgemeinschaft für Resourcen der verschiedenen D. Melanogaster DNA/Vektor/Zelle bei der DGRC kuratiert.

Materials

100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting
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References

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Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).
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