JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/59459
, , ,
1Drosophila Genomics Resource Center, Department of Biology,Indiana University Bloomington

Summary

Drosophila cellijnen zijn belangrijke reagentia voor zowel fundamenteel als biomedisch onderzoek. Dit artikel bevat de protocollen voor ontdooien, subcultuur en cryopreservatie van veelgebruikte Drosophila cellijnen aan onderzoekers helpen om het gebruik van deze reagentia in hun onderzoek op te nemen.

Abstract

Er zijn momenteel meer dan 160 verschillende Drosophila cellijnen, verspreid door de Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Met genoom engineering, het aantal nieuwe cellijnen naar verwachting toenemen. De DGRC is gericht op onderzoekers vertrouwd met het gebruik van Drosophila cellijnen als een experimentele rol aan te vullen en rijden hun onderzoeksagenda. Procedures voor het werken met een verscheidenheid van Drosophila cellijnen met verschillende kenmerken zijn bestemd, met inbegrip van de protocollen voor ontdooien, kweken en cryopreserving van de cellijnen. Deze publicatie toont nog belangrijker is, de beste praktijken vereist om te werken met Drosophila cellijnen om te minimaliseren van het risico van verontreinigingen uit onvoorziene micro-organismen of uit andere cellijnen. Onderzoekers die vertrouwd te met deze procedures raken zullen kunnen ingaan op de vele toepassingen die gebruikmaken van Drosophila gekweekte cellen, met inbegrip van de biochemie, celbiologie en functionele genomica.

Introduction

Het gebruik van Drosophila gekweekte cellen aanvulling in vivo vliegen genetische analyse en dient als een primaire onderzoek instrument voor de aanpak van de vele biologische basisvragen1,–2,3. Drosophila cellijnen bieden unieke homogene populaties van cellen afkomstig van verschillende weefsel bronnen met verschillende genetische achtergronden. Cellijnen zijn geschikt voor vele toepassingen, met inbegrip van transgene genexpressie, genomics, transcriptomics, proteomica, metabolomica, hoge doorvoer RNA interferentie (RNAi) schermen, celbiologie en microscopie. Nog belangrijker is, vergemakkelijkt het gebruik van de cultuur van de cel van de Drosophila de karakterisatie van de onmiddellijke stoffelijke antwoorden op bekende stimuli. Bovendien, de cultuur van de cel van de Drosophila is vatbaar voor CRISPR-Cas9 genoom editing, waardoor het relatief gemakkelijk te maken van nieuwe cellijnen met specifieke genoom wijzigingen4,5,6, 7.

De Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) fungeert als een repository en distributie centrum voor Drosophila cellijnen. Een van de doelstellingen van de DGRC is bij leden van de onderzoeksgemeenschap in Drosophila cel cultuur bronnen gebruiken. Dit artikel presenteert fundamentele protocollen voor het hanteren van Drosophila cellijnen. Het is een aanvulling op bestaande middelen om te helpen de onderzoekers zich comfortabel met de behandeling van Drosophila celculturen en het bereiken van een mate van onafhankelijkheid in hun experimenten1,2,,8,9 ,10.

De meest gebruikte Drosophila cellijnen zijn: Schneider lijnen11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginaire disc en het centrale zenuwstelsel (CNS) lijnen13,14, Milner laboratorium imaginaire schijf lijnen 15, de volwassen ovariële cel lijnen16,17, en het Ras lijnen18 (tabel 1). De Schneider en Kc167 lijnen zijn algemene all-purpose cellijnen voor gebruik in de biochemie, recombinante transgene genexpressie en omgekeerde genetische schermen. De Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) regels zijn afgeleid uit de larvale imaginaire schijven of het centrale zenuwstelsel (CNS) en ze zijn nuttig voor studies met betrekking tot neurosecretion, transcriptieregulatie en RNA verwerking. De regels van de schijf Milner (CME) is belangrijk voor de studie van signaaltransductie geweest. De fGS/OSS cellijnen afgeleid van mutant volwassen eierstokken blijven belangrijke reagentia te bestuderen van de gevolgen van niet-coderende kleine RNA biologie in geslachtscellen onderhoud en differentiatie17,19. Tot slot, de lijnen van het Ras zijn uniek omdat deze cellijnen afgeleid van embryo’s ectopically het uitdrukken van de Ras-oncogen. Ze hebben de transcriptionele ondertekening van spiercellen voorloper en actieve piRNA machines20spreekt. Recente review artikelen en boek hoofdstukken dekken de toepassingen van deze populaire cellijnen met meer details2,–3,9.

Alle deze cellijnen worden overgeënt en bevroren. Er zijn lichte, maar belangrijk verschillende eisen voor hoe elke cellenvariëteit wordt onderhouden en cryopreservatie voorbereid. Bijvoorbeeld, vereisen verschillende cellijnen verschillende media en supplementen (tabel 1). De regels verschillen ook de naleving van de oppervlakte-eigenschappen, morphologies (Figuur 1 en Figuur 2), genotype en verdubbeling tijd (tabel 2). Wij presenteren fundamentele protocollen en markeer de unieke verschillen voor de behandeling van de verschillende gebruikte Drosophila cellijnen.

Protocol

1. ontdooien en heropleving van bevroren Drosophila cellijnen Het steriliseren van de kap door te vegen van het plateau met 70% ethanol. Breng 5 mL van het geschikte medium (tabel 1) in een 25 cm2 T-kolf (T-25). Verwijder de cryovial/ampul uit vloeistof N2 of droog ijs. Veeg de cryovial met 70% ethanol, voorzichtig los en unseal de ampul. Met behulp van een pipet van Pasteur, wordt 1 mL van de temperatuur van de kamer (RT) media opzeggen door de kolf T-25. Voeg langzaam de media in de cryovial en zacht mengen om te ontdooien de bevroren cellen, ervoor te zorgen dat de celsuspensie niet doet overlopen. Breng het gehele volume van de ontdooide celsuspensie uit de ampul in de maatkolf van T-25. Herhaal dit om ervoor te zorgen dat de celsuspensie volledig heeft overgedragen. Plaats de kolf in een incubator 25 ° C, waardoor de cellen te regelen en te houden voor ten minste 2 h. onderzoeken de cellen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de meeste cellen hebben geregeld op het groeiende oppervlak. Zachtjes oude media verwijderen en vervangen door 5 mL verse media. De kolf in de incubator retourneren Op de volgende dag, zachtjes verwijderen van de oude media en vervangen met 5 mL verse media. De cultuur terugkomen in de incubator. 2. ontdooien en heropleving van bevroren Drosophila cellijnen (alternatief) In een steriele kap, Ontdooi de cellen door het resuspending van de bevroren pellet met 1 mL RT media. Alle ontdooide celsuspensie Breng in een conische tube van 15 mL. Pellet de cellen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL verse media. Het gehele volume van de celsuspensie Pipetteer in de kolf van een T-25 en Incubeer de cultuur bij 25 ° C. 1 tot en met 2 h onderzoeken later, de cellen onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat de meeste cellen hebben geregeld op het groeiende oppervlak. De volgende dag, vervangen de oude media met 5 mL verse media en de cultuur terug naar de incubator. 3. subcultuur semi-Adherente cellen gekweekt in 100 mm cultuur platen Het steriliseren van de kap door af te vegen met 70% ethanol. De steriele materialen voor subcultuur brengen de motorkap, met inbegrip van media flessen, pipetten, Pipetteer steun en cultuur platen. De morfologie en de samenvloeiing van de cultuur onder een microscoop onderzocht. Kijk voor duidelijke tekenen van microorganismal besmettingen in de cultuur. Bepalen of de cellen klaar om te worden gepasseerd zijn, gebaseerd op de kenmerken van de cultuur: cel dichtheid en verdubbeling van de tijd, met inbegrip van de laatste keer dat ze werden overgeënt. Als de cultuur sterk lijkt heuvels (Figuur 1), bepalen de celdichtheid. In de steriele kap, de cellen van het groeiende oppervlak te verjagen door pipetteren tot 10 mL van het medium van de plaat en verstrekking van het over de gewenste cellen. Herhaal een paar keer, ervoor te zorgen als u niet wilt maken van schuim, totdat het groeiende oppervlak duidelijk wordt. Het bepalen van de celdichtheid met behulp van een hemocytometer of een automatische deeltjes teller (sectie 5, Figuur 3). Subcultuur de cellen als de celdichtheid tussen 5 x 106 en 1 x 107 cellen/mL.Opmerking: Doen niet subcultuur Drosophila cellijnen aan een celdichtheid lager dan 1 x 106 cellen/mL. Verdun de dienovereenkomstig met behulp van een geschikte voedingsbodem om een eindconcentratie van de seeding van minstens 1 x 106 cellen/mL celsuspensie. Toevoegen voor routine passaging en onderhoud, een passende hoeveelheid celsuspensie naar een vooraf bepaalde hoeveelheid medium in een nieuwe cultuur plaat te bereiken van de gewenste seeding celdichtheid. Breng voor het schalen van een cultuur, alle de celsuspensie in een grote maatkolf. Verdun de celsuspensie naar de gewenste celdichtheid met een passende omvang van het medium. Distribueren van gelijke hoeveelheden van de verdunde celsuspensie aan nieuwe platen. Deze methode minimaliseert de variaties in de celdichtheid tussen platen. Dekken en label van de platen met de initialen van de operator, datum, splitsingsverhouding, seeding celdichtheid, cel lijn id, media, passage nummer en elke media toevoegingen zoals antibiotica. Plaats de platen in een plastic container en het vak terug te keren naar de incubator.Opmerking: tabel 3 lijsten de kweekvat gebruikte voor het kweken van Drosophila cellijnen en de bijbehorende volumes van de werken. 4. verjagend Adherente cellen gekweekt in 100 mm cultuur platen Alle het medium van de plaat overbrengen naar een nieuwe steriele kolf. Sla het medium. Spoel de cellen door langzaam toevoegen van 1 mL trypsine-EDTA 0,05% aan de plaat. Swirl voorzichtig om ervoor te zorgen dat de trypsine oplossing omvat de gehele groei oppervlak. Gooi de trypsine-oplossing. Voeg voorzichtig 1 mL trypsine-EDTA 0,05% aan de plaat. Incubeer de plaat bij 25 ° C tussen 3−10 min terwijl monitoring voor zichtbare tekenen van de cel laag loskoppelen en glijden off het groeiende oppervlak. 9 mL van de opgeslagen medium aan de plaat om te stoppen met trypsine activiteit toevoegen. Meng de celsuspensie om zich te distantiëren van de cel klontjes. Zodra alle cellen hebben verdreven, het groeiende oppervlak zal blijken.Opmerking: Het gebruik van spijsverteringsenzymen zoals trypsine aids in passaging sterk aanhangend cellijnen. Trypsine is een mengsel van proteasen vaak afgeleid van varkens alvleesklier en is commercieel beschikbaar in verschillende kwaliteiten van zuiverheid. 5. handmatige cel tellen met de Neubauer-cel tellen dia De hemocytometer dia en dekglaasje aan voorbereiden door te vegen van het oppervlak met 70% alcohol. Meng de celsuspensie en 15 µL van de celsuspensie afzien in de gegroefde rand van het hemocytometer (figuur 3A) te vullen de eerste kamer van de hemocytometer. Vul de tweede kamer van de hemocytometer. De celsuspensie worden getrokken in de bedwelmingsruimte tellen door capillaire werking. Met behulp van een 10 x Microscoop doelstelling, tellen de cellen binnen het 1 mm2 -gebied in het midden van het raster gebonden door de parallelle lijnen (Figuur 3 c,D). Voorkom dubbele tellen, tellen de cellen die het bedekken van de bovenkant en de linker grenzen, maar niet de cellen die de grenzen van het rechter- en onderkant van de 200 µm2 pleinen. Rekenen tussen de cellen van de 100−200. Herhaal de count en voorzien van de tweede kamer. Berekenen van het gemiddelde van de twee graven en het bepalen van de celdichtheid volgens de volgende formule: celdichtheid (cellen/mL) = gemiddelde cel tellen (n-1 + n2/2) x 104.Opmerking: Levensvatbaarheid van de cellen wordt uitgedrukt als het percentage van levensvatbare cellen over totaal aantal cellen. Om te bepalen de levensvatbaarheid van de cellen, meng de celsuspensie met een gelijk volume trypan blauw (0,4%) oplossing voor handmatige of automatische cel tellen. Levende cellen zal niet duren voordat de kleurstof, terwijl dode cellen zal blauw worden gekleurd. 6. cryopreservatie van Drosophila cellijnen Controleer de cultuur voor gezonde morfologie, groei, en het ontbreken van besmetting. Oogst van de culturen van het midden te laat-log groeifase (stap 3.3 of punt 4). Voor vele Drosophila cellijnen is het ongeveer tussen de 4 x 106 cellen/mL tot 8 x 106 cellen/mL. Spoel de suspensie van de gehele cel in een 15 mL of 50 mL conische buis. De cellen verzamelen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in een volume van bevriezing medium (tabel 4), die in een definitieve celdichtheid van ten minste 4 x 107 cellen/mL resulteren zal. Voeg ontkleuring de juiste hoeveelheid de cryoprotectant dimethylsulfoxide (DMSO) in de celsuspensie zodanig dat de eindconcentratie van DMSO 10 is %. Meng voorzichtig de celsuspensie. Voorzichtig 0,5 mL van de celsuspensie afzien in aliquots van het vooraf gelabelde cryovials (~ 2 x 107 cellen/injectieflacon). Plaats de stimulatiedosis in een bevriezing container gevuld met isopropanol (figuur 4A). Breng de bevriezing container in een vriezer-80 ° C’s nachts om de temperatuur van de cryovials te laten vallen langzaam (-1 ° C/min) tot de temperatuur van de vriezer. Haal de bevroren cryovials en deze snel te koppelen aan stokken (figuur 4B). Plaats de stokken met cryovials in een busje (figuur 4C). U kunt ook plaats bevroren cryovials binnen een vooraf gekoelde bevriezing vak (Figuur 4 d). Winkel cryovials bevroren in de vloeibare fase van N2 diepvriezers (figuur 4E,F).Opmerking: Bij het gebruik van bevriezing media met DMSO, is een vertraging van maximaal 30 min op RT niet schadelijk voor de cellen.

Representative Results

Het is belangrijk om snel ontdooien van bevroren Drosophila cellen en cultuur hen op een celdichtheid die de cultuur terug in de groeifase brengt. Als de procedures voor cryopreservatie en ontdooien in acht worden genomen, zal de celdichtheid in de kolf T-25 ten minste gelijk zijn aan 4 x 106 cellen/mL. Een tot twee uur na het ontdooien, zal meeste Drosophila cellijnen beginnen te hechten aan de groeiende oppervlak. Onder de omstandigheden waarin de meeste van de cellen hebben niet bevestigd op het groeiende oppervlak binnen twee uur na het ontdooien, is het aanbevolen om Incubeer de cellen ‘s nachts voor het veranderen van de media. Het doel van de subcultuur is het handhaven van de cellen in de gezonde exponentiële log-fase van de groeicurve. De criteria voor subcultuur, hangt af van het zichtbare gebrek aan microorganismal besmetting, celdichtheid, en de noodzaak om een regelmatig onderhoudsschema. Het is belangrijk om eerst beoordelen de gezondheid van de cellen en bepalen van het ontbreken van onvoorziene contaminanten voorafgaand aan invriezen. De meeste bacteriële en schimmelinfecties verontreinigingen zijn makkelijk te detecteren door visuele inspecties. Besmette culturen kunnen worden geïdentificeerd door een verhoging in media turbiditeit. Onder de Microscoop weergegeven contaminanten als bacteriële staven, Kokken, ontluikende gistcellen of tekenreeks-achtige schimmel schimmeldraden. Andere bronnen van verontreiniging zoals de niet-cytopathogeen mycoplasma visueel kunnen niet worden gedetecteerd en kunnen routinematig worden getest door PCR-gebaseerde testen21. De samenvloeiing van de cellijn van een kan worden bepaald visueel (Figuur 1). Snel groeiende cellijnen samenvloeiing vroeg bereiken en moeten regelmatig worden gepasseerd. Deze lijnen zijn overgeënt tot twee keer per week. In tegenstelling, zijn traag groeiende cellen gepasseerd ten minste eenmaal per twee weken of langer. De cellen moeten echter worden gevoed verse media elke week. Dit is om te voorkomen dat media uitputting en Verdun stofwisselingsproducten afval uit de cellen. Cellijnen afgeleid van verschillende bronnen in hun morfologie (Figuur 2), naleving van eigenschappen, eisen van de media (tabel 1 verschillen) weefsel en verdubbeling van de tijd (tabel 2). Tabel 5, tabel 6, tabel 7en 8 van de tabel lijst de recepten voor de verschillende Drosophila cel cultuur media. Cel tellen zorgt voor een nauwkeurige seeding dichtheid en een voorspelbare routine voor subcultuur. Voor kwantitatieve experimenten, het tellen van de cel is essentieel. Cellen worden geteld ofwel met behulp van een geautomatiseerde deeltjes teller (figuur 3B) of een hemocytometer (figuur 3A). Als een automatische teller, volgt u de instructies van de fabrikant. Handmatig tellen van cellen is met behulp van een hemocytometer economisch en makkelijk. Het aantal cellen die zijn ingesloten in de middelste Neubauer-rasters zijn geteld en de celdichtheid wordt berekend; Als u bijvoorbeeld n = 214 cellen, wat resulteert in een celdichtheid van 2.14 x 106 cellen/mL (figuur 3D). Celsuspensie uit twee 100 mm platen, elk met 10 mL celsuspensie op 4 x 106 cellen/mL worden verzameld en in 2 mL zuiver bevriezing van media om een bevolkingsdichtheid van 4 x 107 cellen/mL geresuspendeerde. Elke bevroren cryovial met 0,5 mL celsuspensie bevat 2 x 107 cellen. Dit zal resulteren in een cultuur met 4 x 106 cellen/mL wanneer volgens het protocol sectie 1 ontdooid. Figuur 1 : Representatieve beelden van drie verschillende Drosophila cellijnen op verschillende samenvloeiing en cel dichtheden. (A) S2-DGRC cultuur bij 1 x 106 cellen/mL. (A’) S2-DGRC cultuur op 4.5 x 106 cellen/mL. (B) ML-BG2-c2 cultuur bij 2 x 106 cellen/mL. (B’) ML-BG2-c2 cultuur bij 8 x 106 cellen/mL waarin cellen zijn stapelen en aggregeren als foci. (C) OSS cultuur bij 1 x 106 cellen/mL. (C’) OSS cultuur op 4 x 106 cellen/mL. Cellen in suspensie zijn niet is vastgelegd op de dezelfde brandvlak. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Figuur 2 : Representatief beelden van de acht verschillende cellijnen van Drosophila . (A) ronde embryo afkomstige S2-DGRC. (B) ronde embryo-afgeleide Kc167. (C) ronde van larvale CNS afkomstige ML-BG2-c2. (D) ronde larvale spindel-vormig ML-BG3-c2. (E) CME L1, een cellijn afgeleid van de larvale been imaginaire schijven, is kleiner en heeft ronde/sigaarvormig morfologie. (F) OSS, een cellijn afgeleid van volwassen eierstokken, toont spindel-vormig morfologie. (G) Spindle-shaped RasV12 cellijn uiten geactiveerd Ras. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), een uiting van geactiveerde Ras en double-stranded RNA gericht op de tumor suppressor wratten (wts), cellenvariëteit wordt weergegeven de epitheliale kenmerken. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Celdichtheid kan worden geteld handmatig met behulp van een hemocytometer of automatisch met behulp van een geautomatiseerde particle counter. (A) A hemocytometer met twee kamers. (B) een teller van de geautomatiseerde cel weer te geven van de output van een cel tellen. (C) de verbeterde Neubauer cel tellen raster onder de doelstelling van een 10 x bekeken. Cellen tellen gebonden door de 0.1 mm3 centrale raster (rode onderbroken-lijn-plein). (D) de centrale raster op de hemocytometer gevuld met de cellen om te tellen. Schaal bar = 1 mm (C); 0,2 mm (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Apparatuur voor cryopreservatie. (A) A bevriezing container winkels de stimulatiedosis rechtop voor langzaam bevriezen. (B) een metalen stok voor het houden van bevroren stimulatiedosis. (C) A busje voor het houden van de stokken. (D) een plastic bevriezing doos (cryobox). (E) A bus bedrijf meerdere stokken in een opslagtank voor vloeibaar N2 ingevoegd. (F) een vloeibare N2 voorraadtank. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Spanning van de cel Media Naleving van Trypsine Schneider lijnen M3 + BPYE + 10% foetaal kalfsserum (FCS), pH 6.6 Semi-aanhanger No (S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11 Schneider’s media+ + 10% FCS KC lijnen (Kc167, Kc7E10)21,22 M3 + BPYE + 5% FCS, pH 6.6 Semi-aanhanger No Hyclone-CCM3, pH 6.2 Imaginaire disc en CNS lijnen (ML-lijnen)13,14 M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6.6 Semi-aanhanger No 10 µg/mL insuline Milner imaginaire schijf lijnen (CME-lijnen)15 M3 + 2% FCS Semi-aanhanger No 5 µg/mL insuline 2,5% vliegen extract fGS/OSS16 M3 + 10% FCS, pH 6.8 Aanhanger * 10 µg/mL insuline 1 mg/mL C5H8KNO4   0,5 mg/mL KHCO3  Glutathion 0,6 mg/mL 10% vliegen extract RASV12 lijnen18 M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6.6 Aanhanger Ja Tabel 1: De eigenschappen en media eisen van diverse Drosophila cellijnen. Verschillende isolaten van semi-aanhangend Schneider lijnen zoals S2R + S2-Drosophila RNAi Screening Center (DRSC), S2-Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) en Sg4 zijn gebruikte cellijnen die zich krachtig verspreiden wanneer gekweekt in M3 media + Bactopetone gistextract (BPYE) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Als alternatief, Schneiders media (pH 6.7-6,8) wordt vaak gebruikt in plaats van M3 + BPYE. De Kc-lijnen vermenigvuldigen in of M3 + BPYE (5% FCS) of serumvrij CCM3 media. De ML imaginaire schijf en het centrale zenuwstelsel (CNS) lijnen vereisen insuline suppletie voor proliferatie. De lijnen van de imaginaire schijf Milner vereisen zowel insuline en vlieg uittreksel suppletie. Aanhangend fGS/OSS cellijnen vereisen insuline, een hogere concentratie van vliegen extract, alsmede glutathion voor groei. Aanhangend RasV12 lijnen groeien goed in M3 + BPYE (10% FCS). Trypsine wordt gebruikt voor het verjagen van aanhangend cellijnen van het oppervlak van de groei. Cel lijn (voorraad #) Genotype Verdubbeling van de tijd (h) * Weefsel bron S2R + (150) OreR 39 Laat embryo ‘s S2-DGRC (6) OreR 23 Laat embryo ‘s S2-DRSC (181) OreR 46 Laat embryo ‘s Kc167 (1) e/se 22 6−12 h embryo’s ML-BG2-c2 (53) y v f mal 48 3rd instar larvale CNS ML-BG3-c2 (68) y v f mal 104 3rd instar larvale CNS ML-DmD8 (92) y v f mal 66 3rd instar larvale vleugel schijf CME W1 Cl.8+ (151) OreR 46 3rd instar larvale vleugel schijf CME L1 (156) OreR 47 3rd instar larvale been schijf OSS (190) bamD86 45 Volwassen bam mutant eierstokken RASV12 lijnen UAS-GFP; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 41−65 Embryo Tabel 2: Genotype, verdubbeling van de tijd, en weefsel bronnen van wijd gebruikt Drosophila cellijnen. Het weefsel genotype-, bron- en populatieverdubbelingstijd van gebruikte cellijnen worden gepresenteerd. Verdubbeling van de tijd is gebaseerd op groei in de aanbevolen media bij 25 ° C. Cultuur vaartuig Volume van media (mL) 12,5 cm2 T-kolf 2.5 25 cm2 T-kolf 5 75 cm2 T-kolf 15 35 mm plaat 1 60 mm plaat 4 100 mm plaat 10 384-well plaat * 0.04 per putje 96-wells-plaat * 0.1/putje 48-well plaat * 0,3 per putje 24-well plaat * 0,5/putje 12-well plaat 1.0/putje 6-well plaat 2.0/putje Tabel 3: cultuur van schepen en de aanbevolen media volumes. Kweekvat van verschillende grootte zijn beschikbaar voor het kweken van Drosophila cellen. De juiste media volumes (mL) worden aanbevolen voor elk vaartuig. Zegel multi goed platen met minder dan 0,5 mL celsuspensie met paraffine film om media verlies als gevolg van verdamping. Volume M3 + BPYE, pH 6.6 70 mL Warmte geïnactiveerd FCS 20 mL Steriele gefilterde DMSO * 10 mL Tabel 4: recept voor het voorbereiden van 100 mL van bevriezing medium (M3 + BPYE, 20% FCS, 10% DMSO). Bereiden van bevriezing media desgewenst en Vermijd bevriezing media met DMSO gedurende langere periode op te slaan. M3 + BPYE medium Bedrag Shields en zong de M323 1 fles KHCO3 0.5 g Selecteer gistextract 1,0 g Bactopeptone 2,5 g Steriele gezuiverd water 1000 mL Tabel 5: Recept voor het voorbereiden van 1 L van M3 + BPYE weefsel kweekmedium. Breng de pH op 6,6. Steriliseren door het medium door een 0,22 µm filter. Basis M3 medium voor cellijn fGS/OSS Bedrag Shields en zong M3 1 fles KHCO3 0.5 g C5H8KNO4   1,0 g Steriele gezuiverd water 1000 mL Tabel 6: Recept voor 1 L van fGS/OSS M3 basis medium. Breng de pH op 6,8. Steriliseren door het medium door een 0,22 µm filter. Hyclone-CCM3 Bedrag CCM3 poeder 28.6 g NaHCO3 0.35 g 10 N NaOH 2,5 mL CaCl2 0.5 g Steriele gezuiverd water 1000 mL Tabel 7: Recept voor 1 liter Hyclone-CCM3 weefsel kweekmedium. Breng de pH op 6.2. Steriliseren door het medium door een 0,22 µm filter. M3 + BPYE + 10% FCS Miyake schijf en CNS lijnen medium Milner schijf lijnen middellange fGS/OSS compleet medium M3 + BPYE, pH 6.6 90 mL 90 mL – – Warmte geïnactiveerd FCS * 10 mL 10 mL 2 mL 10 mL Insuline (10 mg/mL) – 100 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Vliegen extract – – 2,5 mL 10 mL Glutathion (60 mg/mL) – – 1 mL M3, pH 6.6 – – 97,5 mL – fGS/OSS M3, pH 6.8 – – 79 mL Tabel 8: Recept voor het voorbereiden van 100 mL voor verschillende common Drosophila cel voedingsbodems. Incubeer FCS bij 56 ° C gedurende 1 h staan en schud nu elke vijf minuten om warmte-inactivering van aanvulling eiwitten.

Discussion

Drosophila celculturen zijn primaire reagentia voor hoge doorvoer cel-gebaseerde schermen. Hun gebruik vult ook in vivo genetisch onderzoek door middel van een homogene bevolking van cellen geschikt voor Biochemie, snelle van transgene constructies vóór het injecteren in vliegen, celbiologie, microscopie en meer recentelijk somatische cel genetische testen manipulaties door genoom1,2,3,8,9,10te bewerken.

De levensvatbaarheid en de invordering van bevroren Drosophila cellen is kwetsbaar voor schommelingen van de drastische zelfs bij lage temperaturen. De DGRC vervoert ze in droog ijs (-78.5 ° C) en bevroren cellijnen worden opgeslagen in de vloeibare fase van N2 (196 ° c.). Bevroren stimulatiedosis die in droog ijs zijn vervoerd moeten niet worden overgedragen terug in vloeistof N2 of een vriezer-80 ° C voor opslag. In plaats daarvan moeten de bevroren cellen ontdooid, reseeded op een hoge celdichtheid zo spoedig mogelijk bij aankomst (protocol sectie 1) en gekweekte voor hun beoogde doeleinden (protocol sectie 3). Als de cellijnen zijn niet onmiddellijk wordt gebruikt voor experimenten, de cel lijnen moeten worden cryopreserved (protocol sectie 6) totdat ze klaar voor gebruik zijn.

Sommige cellijnen, zoals de ML-BG2-c2 en Ras moeten enkele dagen om te herstellen van de gevolgen van het uit de cryopreserved staat nieuw leven wordt ingeblazen. Een aanzienlijke hoeveelheid cellulaire puin begeleidt deze cellijnen de eerste paar dagen na het ontdooien. Ongemoeid gelaten, zal de cellen herstellen en vermenigvuldigen. Vele Drosophila cellijnen op de DGRC zijn aangepast om te groeien in M3 gebaseerd media22. Voor cellijnen die traag om te herstellen van de gevolgen zijn van het ontdooien, kan het gebruik van geconditioneerde media nuttig zijn. Geconditioneerde media waarschijnlijk bevatten groeifactoren uitgescheiden door de cellen in de media die het herstel en de proliferatie van de cellen na het ontdooien stimuleren kan.

Cellijnen in het algemeen volgen een stereotiepe groeicurve, bestaande uit een fase lag, exponentiële fase, plateau fase en een verslechtering van de fase. Vele Drosophila cellijnen vermenigvuldigen in de log-fase van groei wanneer ze worden gekweekt op een dichtheid tussen 1 x 106 en 1 x 107 cellen/mL bij 25 ° C. Het is essentieel dat cellijnen zijn gepasseerd, zodanig dat zij altijd in de exponentiële groeifase zijn.

De samenvloeiing van een cultuur, uitgedrukt als een percentage, beschrijving van de oppervlakte van de groei die wordt gedekt door cellen. Samenvloeiing van de cel voor een cellijn hangt af van de cel vorm en grootte. Verschillende cellijnen beschikken over verschillende morphologies en naleving van eigenschappen. Dientengevolge, wellicht verschillende cellijnen aan ongeveer vergelijkbaar samenvloeiing enorm verschillende celdichtheid (Figuur 1). Cultuur samenvloeiing kan niet worden een ideale indicator voor passaging van Drosophila celculturen omdat Drosophila cellijnen vermenigvuldigen blijven hetzij door stapelen op de top van elkaar als foci of in suspensie, zelfs nadat het oppervlak van de groei is geweest overdekte (Figuur 1). Echter, gebruikers ervaren met specifieke cellijnen kunnen gebruiken vaak samenvloeiing als een snelle visuele gids voor wanneer naar de subcultuur.

Hoewel het is mogelijk om te groeien van Drosophila lijnen op ambient RT tussen 19−25 ° C, is het niet aanbevolen omdat schommelingen van de omgevingstemperatuur van invloed kunnen zijn op de proliferatie tarief. Het gebruik van een speciale 25 ° C incubator is aanbevolen. De incubator voor Drosophila celculturen hoeft niet te vergemakkelijken van CO2 gasuitwisseling omdat Drosophila cel voedingsbodems gebruik geen CO2 voor het bufferen. De vochtigheid in de incubator voor het kweken van cellijnen is een belangrijke factor niet te vergeten bij het kweken van cellen in platen. Afhankelijk van het type op incubator en het arbeidsmilieu te bevorderen, het mogelijk moet plaats een bekerglas steriel water binnen de incubator. U wilt minimaliseren media verdamping, gesloten T-kolf of bewaar cultuur platen in een strak verzegelde plastic container terwijl hij in de incubator.

Het is belangrijk om een tijdschema voor de subcultivering van Drosophila cellijnen. Als u wilt schatten de groei tarief en monitor consistentie, is het handig om een subcultuur op een zelfs geometrische verhouding (split verhouding 1:2, 1:4, 1:8). Bijvoorbeeld, kan een plaat 10 mL confluente Kc167 cellen op 8 x 106 cellen/mL op 1:8 in verhouding tot het bereiken van een seeding dichtheid van 1 x 106 cellen/mL (1,25 mL celsuspensie verdund in 8.75 mL verse media) worden gesplitst. In 72 h verwachting Kc167 culturen te verspreiden met een dichtheid van 8 x 106 cellen/mL, gezien de verdubbeling tijd van 24 uur. De splitsingsverhouding wordt daarom bepaald ter vergemakkelijking van een handige subcultuur routine van maximaal twee keer per week, ervoor te zorgen dat de cellen altijd in hun exponentiële log fase van groei gekweekt worden. Dit zorgt voor een regelmatig schema voor de subcultivering van de cellen, zodat de tijd tot samenkomst niet te kort of te lang is. Als de tijd tot samenkomst te kort is, worden de cellen overgeënt op een lagere celdichtheid (hogere splitsingsverhouding). Evenzo, als de tijd om het bereiken van de samenvloeiing te lang is, de cellen worden overgeënt op een hogere celdichtheid (lagere splitsingsverhouding). Het is belangrijk op te merken dat de meeste Drosophila cellijnen zeer gevoelig voor lage cel dichtheden zijn (< 1 x 105 cellen/mL), in welke cellen nauwelijks vermenigvuldigen en kunnen uiteindelijk sterven.

Drosophila cellijnen verschillen in groei kenmerken en morfologie. Dientengevolge, cellijnen met verschillende eigenschappen mogelijk moet anders worden behandeld. Meeste Drosophila cellijnen zijn semi-aanhangend. Bij lagere celdichtheid; zij zich sterker aan de oppervlakte groei en naarmate de cultuur confluente, de cellen worden minder aanhangend en gemakkelijk losmaken. Deze geleidelijke verandering in de naleving van de cel bevordert gemakkelijk subcultuur van de wijdst gebruikte Drosophila cellijnen (Schneider, Kc lijnen, imaginaire remschijf en CNS lijnen) zoals het maakt de exploitant aan gewoon afzien media over de cel enkelgelaagde te verjagen ze van het oppervlak van de groei wanneer de cultuur dicht is. Voor lijnen die oppervlakte aanhanger zoals zijn de vrouwelijke germinale stam/ovariële somatische schede (fGS/OSS) en de Ras-lijnen, het is essentieel voor Incubeer de cellen in trypsine voor een korte duur om te helpen bij het losmaken van de cellen van het oppervlak van de groei.

Media toevoegingen voor meeste Drosophila cellijnen zijn foetaal kalfsserum (FCS) zijn. Insuline en volwassen vliegen extract (FEX) zijn vereist voor sommige specifieke lijnen. FEX bevat niet-gedefinieerde componenten essentieel voor de groei van specifieke larvale imaginaire schijf lijnen en de volwassen ovariële cellijnen. De DGRC bereidt en maakt beschikbaar volwassen FEX afgeleid van 1 week oud Oregon-R-modENCODE vliegen (RRID: BDSC_25211) in 2,5 mL en 10 mL aliquots. De DGRC bevat ook instructies voor kleinschalige FEX voorbereiding op haar website . FEX voorbereiding, echter is tijdrovend en vereist een grote hoeveelheid volwassen vliegen.

Cryopreservatie van Drosophila cellijnen bespaart tijd en reagentia voor het onderhoud van de cellijnen niet in onmiddellijk gebruik. Cryopreservatie wordt bereikt door langzaam de bevriezing van de cellen (-1 ° C/min) tot-80 ° C in een medium met DMSO, een agent cryoprotective. De langzame afkoeling stap is cruciaal voor succesvolle cryopreservatie. In een diepvriezer-80 ° C, wordt de ampul van cellen afgekoeld met een snelheid van-1 ° C/min wanneer geplaatst in een bevriezing container gevuld met isopropanol. Beginnend bij 25 ° C omgevingstemperatuur, duurt maximaal 2 uur voor de temperatuur in de stimulatiedosis te bereiken-80 ° C. Het is aanbevolen om de stimulatiedosis te bevriezen ‘s nachts verlaten.

Bevroren stimulatiedosis moeten vervolgens snel worden overgebracht naar de vloeibare fase van stikstof voor langdurige opslag. Bij omgevingstemperatuur, de cryovial zal snel opwarmen op ongeveer 10 ° C/min en de levensvatbaarheid zal worden aangetast bij boven-50 ° C23. Om de overdracht snelle, omgaan met stimulatiedosis in kleine batches te minimaliseren van de blootstelling aan omgevingstemperatuur. Als alternatief, de bevroren cryovials plaats op droog ijs terwijl de voorbereiding van de overdracht daarvan in vloeibare N2. Als vloeibare stikstof niet beschikbaar is, kunnen de cellen worden bewaard in een diepvriezer-80 ° C, hoewel met een risico van significante verslechtering na verloop van tijd.

Celdichtheid is essentieel voor succesvolle cryopreservatie en de latere herleving van cellijnen. In het algemeen, nieuwe cel lijnen moeten worden bevroren tot de eerste bevriezen (1−3 stimulatiedosis), zodra een overmaat van cellen beschikbaar. Zodra de cellijn is stabiel verder is gekweekte, moet een bevroren voorraad van 10−20 stimulatiedosis worden gemaakt. Deze voorraad is dan om te controleren voor zijn herstel na bevriezing cel en levensvatbaarheid, waarna het wordt doorgegeven voor experimenten of ter vervanging van de voorraad wanneer het aantal bevroren voorraad stimulatiedosis hieronder vijf valt ontdooid. Tot slot is het belangrijk om te valideren dat de ontdooide cellen de eigenschappen van haar ouderlijke materieel behouden zoals cellijnen zijn gekend om te evolueren van3,24.

Kortom, presenteert dit artikel een primer voor het werken met Drosophila celculturen door het verstrekken van de fundamentele informatie over de verschillende lijnen, beste praktijken en audiovisuele protocollen voor de elementaire behandeling van Drosophila cellijnen. Deze toegankelijke bron is bedoeld om te soepel verminderen de inleiding tot het werken met gekweekte Drosophila cellen en als aanvulling op bestaande Trainingshandleidingen bij elke research laboratory.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken de National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) en de onderzoekswereld voor het gebruik van de verschillende soorten D. melanogaster DNA/vector/cel middelen samengesteld op de DGRC.

Materials

100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).
  2. Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
  3. Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
  4. Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
  5. Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
  6. Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
  7. Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
  8. Echalier, G. . Drosophila Cells in Culture. , (1997).
  9. Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. . Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).
  10. Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. . Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).
  11. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
  12. Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
  13. Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
  14. Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
  15. Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
  16. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
  17. Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
  18. Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
  19. Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
  20. Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
  21. Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
  22. Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
  23. Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).
  24. Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).

Tags

Drosophila Cell LinesThawingCulturingCryopreservingCell CultureCell SuspensionCell DensityCell ProliferationCell ViabilityCell MorphologyLaminar Flow HoodCell Culture MediaCentrifugationCell PassageMicroorganismal Contamination

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image