JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/59459
, , ,
1Drosophila Genomics Resource Center, Department of Biology,Indiana University Bloomington

Summary

Drosophila hücre hatları temel ve Biyomedikal Araştırma önemli Kimyasalları vardır. Bu makalede çözdürme, subculturing ve araştırmacılar araştırma bu Kimyasalları kullanımı birleşmeyle yardımcı olmak için yaygın olarak kullanılan Drosophila hücre satırları dondurma protokolleri sağlar.

Abstract

Sitemizde şuan Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) tarafından dağıtılan 160 ayrı Drosophila hücre hatları üzerinden. Genom Mühendisliği ile roman hücre satır sayısını artırması bekleniyor. DGRC deneysel bir aracı olarak tamamlayan ve onların araştırma gündemi sürücü Drosophila hücre hatları kullanarak araştırmacılar tanıtmak amaçlanmaktadır. Çözdürme, kültür ve hücre hatları cryopreserving için protokol de dahil olmak üzere Drosophila hücre hatları farklı özelliklere sahip çeşitli ile çalışmaya yönelik yordamlar verilmektedir. Önemlisi, bu yayın contaminations adventif mikroorganizmalar veya diğer hücre hatları riskini en aza indirmek için Drosophila hücre hatları ile çalışması gereken en iyi yöntemleri gösterir. Bu yordamları ile aşina olmak araştırmacılar kültürlü Drosophila hücrelerin biyokimya, hücre biyolojisi ve fonksiyonel genomik gibi kullanan birçok uygulamalar delve edebilecektir.

Introduction

Drosophila kullanımı tamamlar içinde vivo genetik analiz sinek ve birçok temel biyolojik sorular1,2,3adresleme için birincil araştırma aracı olarak hizmet veren hücreler kültürlü. Drosophila hücre hatları farklı genetik kökenli farklı doku kaynaklardan elde edilen hücre benzersiz homojen nüfus sunuyoruz. Hücre hatları transgenik gen ekspresyonu, genomik, transcriptomics, proteomik, metabolomics, yüksek işlem hacmi RNA müdahale (RNAi) ekranlar, hücre biyolojisi ve mikroskobu gibi birçok uygulamalar için uygundur. Önemlisi, bilinen uyaranlara karşı hemen geçici yanıt karakterizasyonu Drosophila hücre kültürü kullanımını kolaylaştırır. Ayrıca, Drosophila hücre kültürü düzenleme, nispeten kolay belirli genom değişiklikler4,5,6ile, yeni hücre satırları oluşturmak için yapım CRISPR Cas9 genom mükellef 7.

Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) Drosophila hücre hatları için bir depo ve dağıtım merkezi olarak hizmet vermektedir. DGRC amaçlarından biri de Drosophila hücre kültür kaynakları kullanarak araştırma topluluk üyeleri yardımcı olmaktır. Bu makale Drosophila hücre satırlarını işleme için temel iletişim kuralları sunar. Drosophila hücre kültürleri işleme ile rahat olmak ve bağımsızlık kendi deneyleri1,2,8,9 seviyesindeki araştırmacılar yardımcı olmak için mevcut kaynakları tamamlar ,10.

En sık kullanılan Drosophila hücre hatları: Schneider hatları11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake Imaginal disk ve merkezi sinir sistemi (MSS)13,14, Milner laboratuvar Imaginal disk satırları satırları 15, Yetişkin yumurtalık hücre hatları16,17ve Ras hatları18 (Tablo 1). Schneider ve Kc167 satırları biyokimya, rekombinant transgenik gen ekspresyonu ve ters genetik ekranlar için genel amaçlı cep çizgiler vardır. Mitsubishi/Miyake laboratuvar (ML) satırları ya larva Imaginal diskler ya da merkezi sinir sistemi (MSS) elde edilmiştir ve neurosecretion, transkripsiyon yönetmelik ve RNA işlenmesi ile ilgili çalışmaları için yararlı olmuştur. Milner (CME) disk satırları sinyal iletimi eğitimi için önemli bir şey. Mutasyona uğramış yetişkin yumurtalık türetilmiş fGS/OSS hücre satırlar kodlamayan RNA küçük, biyoloji germ hücreli bakım ve farklılaşma17,19etkisini incelemek için önemli reaktifler kalır. Son olarak, çünkü ectopically Ras onkogen ifade embriyo elde edilen hücre hatları bunlar Ras satırlar benzersizdir. Onlar kas öncü hücrelerinin transkripsiyon imzaya sahip ve aktif piRNA makine20ifade eder. Son derleme ve kitap bölümleri daha fazla ayrıntılı bilgi2,3,9popüler hücre et uygulamaları kapsar.

Bu hücre satırları subcultured ve donmuş. Her hücre kültürünü nasıl tutulur ve dondurma için hazırlanan için küçük ama önemli farklı gereksinimleri vardır. Örneğin, farklı hücre hatları farklı medya ve takviyeleri (Tablo 1) gerektirir. Satırları yüzey yapışma özellikleri, türleri Morfoloji (Resim 1 ve Şekil 2), genotip ve katlama zaman (Tablo 2) de değişir. Biz temel iletişim kuralları sunmak ve çeşitli yaygın olarak kullanılan Drosophila hücre satırlarını işlemek için benzersiz farklılıkları vurgulayın.

Protocol

1. çözülme ve canlandırıcı dondurulmuş Drosophila hücre hatları Başlık çalışma yüzeyi % 70 etanol ile silerek sterilize. Uygun orta (Tablo 1) 5 mL 25 cm2 T-şişesi (T-25) dağıtmak. Cryovial/ampul sıvı N2 veya kuru buz kaldırma. Cryovial % 70 etanol ile silin, dikkatle gevşetin ve ampul açıldı. Pasteur pipet kullanarak, oda sıcaklığında (RT) medya 1 mL T-25 şişeye geri alıyorum. Yavaş yavaş cryovial medya ekleyin ve karışımı yavaşça donmuş hücreleri hücre süspansiyon değil taşması sağlanması, çözülme. Birimin tümü çözdürülen hücre süspansiyon ampul T-25 şişesi aktarın. Hücre süspansiyon tamamen transfer edildi emin olmak için yineleyin. 25 ° C kuluçka makinesine şişeye koyun, hücreleri en hücreleri artan yüzeyinde yerleşmiş emin olmak için mikroskop altında incelemek hücrelere yerleşmek ve en az 2 h. için uygun izin. Yavaşça eski medya kaldırın ve 5 mL taze medya ile değiştirin. Şişeye kuluçka makinesi dönün. Ertesi gün, yavaşça eski medya kaldırın ve 5 mL taze medya ile değiştirin. Kültür için kuluçka dönün. 2. çözülme ve canlandırıcı dondurulmuş Drosophila hücre hatları (seçimli) Steril bir başlık, 1 mL RT medya ile dondurulmuş Pelet resuspending tarafından hücreleri çözülme. Çözdürülen hücre süspansiyon 15 mL konik tüp içine aktarın. Hücreleri tarafından Santrifüjü 1000 x g 5 dk. atmak için de süpernatant cips ve hücre Pelet 5 mL taze medya resuspend. Tüm birim hücre süspansiyon, bir T-25 şişesi aktarmak ve kültür 25 ° C’de kuluçkaya 1-2 h sonra hücreleri en hücreleri artan yüzeyinde yerleşmiş emin olmak için mikroskop altında incelemek. Ertesi gün, eski ortamı ile 5 mL taze medya değiştirin ve kültür için kuluçka dönün. 3. subculturing yarı yapışık hücreleri 100 mm kültür levha yetiştirilen Başlık % 70 etanol ile silerek sterilize. Subculturing için steril malzemeler medya şişeleri, Pipetler, pipet yardım ve kültür tabak gibi başlık getirin. Morfoloji ve izdiham kültür bir mikroskop altında incelemek. Kültür microorganismal contaminations net işaretler arayın. Hücreleri pasajlı için hazır olup olmadığını belirlemek kültür özelliklerine göre: hücre yoğunluğu ve zaman, en son ne zaman onlar subcultured dahil iki katına çıkarın. Eğer kültür yüksek gözükmek birleşmesi (şekil 1), hücre yoğunluğu belirlemek. Steril mahallede büyüyen yüzeyine hücrelerinden plaka ortamından ilâ 10 mL pipetting ve hücrenin üzerine dağıtımı tarafından çıkarmak. Birkaç kez, büyüyen yüzeyi açık hale gelinceye kadar köpük, yaratmak için değil sağlanması yineleyin. Bir hemasitometre veya bir otomatik parçacık sayaç (Bölüm 5, şekil 3) kullanarak hücre yoğunluğu belirlemek. Alt kültür hücreleri hücre yoğunluğu 5 x 106 ve 1 x 107 hücre/mL arasında ise.Not: Değil alt kültür Drosophila hücre hatları için bir hücre yoğunluğu 1 x 106 hücre/mL altında yapmak. Buna göre en az 1 x 106 hücre/mL nihai bir tohumlama konsantrasyon için uygun bir ortam kullanarak hücre süspansiyon sulandırmak. Rutin passaging ve bakım için önceden belirlenmiş bir birime orta istenen tohumlama hücre yoğunluğu sağlamak için yeni bir kültür plaka hücre süspansiyon uygun bir hacmi ekleyin. Bir kültür ölçekleme için tüm hücre süspansiyon büyük bir şişesi aktarın. Hücre süspansiyon için uygun bir birimdeki orta istenilen hücre yoğunluğu oranında seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyon yeni plakalar için eşit miktarda dağıtın. Bu yöntem hücre yoğunluğu plaka arasındaki varyasyonları en aza indirir. Kapak ve etiket plakaları operatör baş harfleri, Tarih, split oranı, tohumlama hücre yoğunluğu, hücre satırı tanımlayıcıları, medya, geçiş numarası ve antibiyotikler gibi herhangi bir medya ekleme. Tabakları bir plastik konteyner içine yerleştirin ve kutusuna da kuluçka için dönün.Not: Tablo 3 Drosophila hücre satırları ve ilişkili çalışma birimleri kültür için yaygın olarak kullanılan kültür damarları listeler. 4. kekii 100 mm kültür levha yetiştirilen yapışık hücreleri Tüm Orta plaka için yeni bir steril şişe aktarın. Orta kaydedin. Hücreleri 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA plakasına yavaş yavaş ekleyerek durulayın. Tripsin çözüm tüm büyüme yüzey kapsar emin olmak için yavaşça girdap. Tripsin çözüm atın. Yavaşça 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA plaka ekleyin. 25 ° c arasında hücre katmanı ayırma görünür işaretleri için izleme ve sürgülü büyüyen yüzeyi kapalı iken 3−10 min plaka kuluçkaya. Kaydedilmiş orta 9 mL tripsin etkinliğini durdurmak için plaka ekleyin. Hücre kümeleri ayırmak için hücre süspansiyon karıştırın. Bir kez tüm hücreleri yerinden, büyüyen yüzeyi açık olacak.Not: Güçlü yapisan hücre hatları passaging içinde tripsin AIDS gibi sindirim enzimleri kullanımı. Tripsin proteaz kez domuz pankreas türetilmiş bir karışımıdır ve saflık farklı sınıflarda ticari olarak kullanılabilir. 5. el ile hücre kullanarak slayt sayımı Neubauer Hücre sayımı Hemasitometre slayt ve coverslip % 70 alkol ile yüzey silerek hazırlayın. Hücre süspansiyon mix ve hücre süspansiyon 15 µL yivli (hemasitometre ilk TMMOB doldurmak için,şekil 3A) hemasitometre kenarına dağıtmak. Hemasitometre ikinci TMMOB doldurun. Hücre süspansiyon kılcal eylem tarafından sayım odasına çekilecek. 10 x mikroskop objektif kullanarak, 1 mm2 alanı paralel çizgiler (şekil 3 c,D) tarafından bağlı kılavuz ortasında içinde hücreleri saymak. Yinelenen sayma önlemek için üst ve sol sınırları yerleşimi hücreleri, ama değil 200 µm2 kareler sağ ve alt sınırları çapraz hücre sayısı. 100−200 hücreler arasında saymak. İkinci odası sayısıyla yineleyin. İki adet ortalamasını hesaplamak ve hücre yoğunluğu aşağıdaki formüle göre belirlemek: hücre yoğunluğu (hücre/mL) ortalama hücre sayısı (n1 + n2/2) x 10 =4.Not: Hücre canlılığı üzerinde toplam hücreler hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Hücre canlılığı belirlemek için hücre süspansiyon (% 0,4) trypan mavi eşit bir hacmi ile karıştırın el ile veya otomatik Hücre sayımı önce çözüm. Ölü hücreleri mavi lekeli iken canlı hücreleri boya kadar etkili olmayacaktır. 6. Drosophila hücre satırları dondurma Kültür sağlıklı morfolojisi, büyüme ve kontaminasyon olmaması için kontrol edin. Kültürler hasat ortalarında geç günlük büyüme aşamasına (Adım 3.3 veya bölüm 4). Birçok Drosophila hücre hatlarında, bu yaklaşık 4 x 106 hücre/mL 8 x 106 hücre/ml arasındadır. Tüm hücre süspansiyon 15 mL veya 50 mL konik tüp içine aktarın. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından hücreleri toplamak ve süpernatant atın. Hücre Pelet bir birimdeki bir son hücre yoğunluğu en az 4 x 107 hücre/mL neden olur donma orta (Tablo 4) resuspend. Öyle ki son DMSO konsantrasyonu % 10 dropwise cryoprotectant Dimetil sülfoksit (DMSO) uygun miktarda hücre süspansiyon ekleyin. Hücre süspansiyon karışımı yavaşça. Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon 0.5 mL önceden etiketli cryovials (~ 2 x 107 hücreler/şişe) aliquots içine dağıtmak. Ampul isopropanol (şekil 4A) ile dolu bir dondurucu kaba yerleştirin. Dondurma konteyner yavaş yavaş düşmeye cryovials sıcaklığını izin vermek için bir-80 ° C dondurucu içine gecede transfer (-1 ° C/dak) derin dondurucu sıcaklık için. Donmuş cryovials almak ve hızlı bir şekilde köpekler (şekil 4B) ekleyebilirsiniz. Cryovials bir teneke kutu (şekil 4 c) içeren köpekler yerleştirin. Alternatif olarak, donmuş cryovials önceden soğutulmuş dondurucu kutusunun (şekil 4 d) içine yerleştirir. Mağaza cryovials N2 derin Dondurucular (şekil 4E,F) sıvı faz donmuş.Not: Dondurucu medya içeren DMSO kullanırken, RT, 30 dakikaya kadar bir gecikme hücrelere zararlı değildir.

Representative Results

Donmuş Drosophila hücreleri hızla çözülme ve onları kültür geri büyüme aşamasında içine getiriyor bir hücre yoğunluğu, kültür önemlidir. Dondurma ve çözme için yordamlar yapıştırılır vardır T-25 şişeye hücre yoğunluğu en az 4 x 106 hücre/mL eşit. 1-2 saat sonra çözülme, çoğu Drosophila hücre hatları büyüyen yüzeye eklemek başlar. Hangi hücrelerin çoğu büyüyen yüzeyde çözdürme sonra iki saat içinde ekli değil durum altında bu gecede medya değiştirmeden önce hücreleri kuluçkaya önerilir. Subculturing amacı büyüme eğrisi sağlıklı üssel günlük-faz hücrelerinde muhafaza etmektir. Subculturing ölçütlerini microorganismal kirlenme, hücre yoğunluğu ve düzenli bakım zamanlamayı gerek görünür olmaması bağlıdır. İlk hücrelerin sağlığını değerlendirmek ve donma önce adventif kirletici yokluğu belirlemek önemlidir. Çoğu bakteri ve mantar kirletici maddeler sadece görsel denetimler tarafından tespit etmek kolaydır. Kirlenmiş kültürleri medya bulanıklık içinde artış tarafından tespit edilebilir. Mikroskop altında kirletici bakteriyel çubuklar, cocci, Maya hücreleri veya dize gibi mantar hif tomurcuklanma görünebilir. Diğer kaynakları kirlenme cytopathic sigara Mikoplazma gibi görsel olarak tespit edilemez ve rutin deneyleri PCR tabanlı21tarafından test edilecek. Bir hücre kültürünü izdiham görsel olarak belirlenebilir (şekil 1). Hızlı büyüyen hücre hatları kesiştiği yerde erken ulaşmak ve düzenli olarak pasajlı gerekir. Bu satırları haftada iki gün kadar subcultured. Buna ek olarak, yavaş büyüyen hücreler pasajlı en az bir kez her iki hafta veya daha uzun. Ancak, hücreleri taze medya her hafta beslenmeleri gerekir. Medya tükenme önlemek için ve hücreler metabolik atık ürünleri sulandırmak için bu. Hücre hatları kaynakları onların morfolojisi içinde (Resim 2), bağlılık özellikleri, ortam gereksinimleri (Tablo 1) farklı doku değişen ve zaman (Tablo 2) iki katına türetilmiştir. Tablo 5, Tablo 6, Tablo 7ve Tablo 8 çeşitli Drosophila hücre kültür medya tariflerini listelenmektedir. Hücre sayımı doğru bir tohumlama yoğunluk ve subculturing için öngörülebilir bir yordam sağlar. Nicel deneyler için Hücre sayımı esastır. Hücreleri bir hemasitometre (3A rakam) veya bir otomatik parçacık sayacı (3B rakam) kullanarak dikkate alınır. Bir otomatik sayaç kullanıyorsanız, üreticinin yönergeleri izleyin. Hücreleri elle sayım bir hemasitometre ekonomik ve kolay kullanmaktır. Orta Neubauer Kılavuzlar içinde kapalı hücre sayısı dikkate alınır ve hücre yoğunluğu hesaplanır; Örneğin, n = 106 hücre/mL (şekil 3D) x 2,14 hücre yoğunluğu sonuçlanan 214 hücre. Hücre süspansiyon iki 100 mm tabak, 4 x 106 hücre/mL, hücre süspansiyon içeren her 10 mL üzerinden toplanan ve 4 x 107 hücre/mL yoğunluğu elde etmek için medya buz gibi 2 mL içinde resuspended. Hücre süspansiyon 0.5 mL ile dondurulmuş her cryovial 2 x 107 hücreler içeriyor. Bu bir kültür 4 x 106 hücre/mL 1 kısmı protokole göre çözdürülen zaman ile sonuçlanır. Resim 1 : Üç farklı temsilcisi görüntüleri Drosophila hücre hatları farklı izdiham ve hücre yoğunlukları. (A)S2-DGRC 1 x 106 hücre/mL kültür. (A’) 4.5 x 106 hücre/mL, S2-DGRC kültür. (B) ML-BG2-c2 2 x 106 hücre/mL kültür. (B’) 8 x 106 hücre/mL hangi hücreleri kazık ve foci toplayarak ML-BG2-c2 kültür. 1 x 106 hücre/mL, (C) OSS kültür. (C’) 4 x 106 hücre/mL, OSS kültür. Süspansiyon hücrelerde aynı odak düzlemi üzerinde yakalanan değil. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  Resim 2 : Sekiz ayrı Drosophila hücre hatları temsilcisi görüntüler. (A)yuvarlak embriyo elde edilen S2-DGRC. (B) yuvarlak embriyo elde edilen Kc167. (C) yuvarlak larva CNS kaynaklı ML-BG2-c2. (D) yuvarlak larva ML-BG3-c2 seklinde. (E) CME L1, larva bacak Imaginal disklerinden türetilmiş bir hücre kültürünü daha küçük ve yuvarlak/fusiform morfolojisi vardır. (F) OSS, Yetişkin yumurtalık türetilmiş bir hücre kültürünü Morfoloji seklinde görüntüler. (G) RasV12 seklinde hücre kültürünü ifade Ras aktif. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), etkin Ras ve çift iplikçikli RNA Tümör baskılayıcı siğiller (wts), hedefleme ifade bir hücre kültürünü epitel özellikleri görüntüler. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Hücre yoğunluğu bir hemasitometre kullanarak el ile veya otomatik olarak bir otomatik parçacık sayaç kullanarak sayılır. (A) A hemasitometre iki odaları ile. (B) bir hücre sayısı çıktısını görüntüleme bir otomatik hücre sayaç. (C) geliştirilmiş Neubauer hücre kılavuz sayım 10 x amaç altında görüntülendi. 0,1 mm3 Merkez kılavuz (kırmızı kesik çizgili kare) tarafından bağlı hücreleri saymak. (D) hücre sayımı için merkezi ağ hemasitometre’dolu. Ölçek çubuğu = 1 mm (C); 0.2 mm (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Dondurma donatımı. (A) A dondurma konteyner mağazaları ampul dik bir pozisyonda yavaş dondurma için. (B) A metal baston donmuş ampul tutmak için. (C) A teneke kutu köpekler tutmak için. (D) A plastik dondurma kutusu (cryobox). (E) A kutu birden çok köpekler bir sıvı N2 depolama tankı eklenen tutarak. (F) sıvı N2 depolama tankı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Hücre zorlanma Medya Bağlılık Tripsin Schneider satırları M3 + BPYE + fetal buzağı serum (FCS), pH 6,6 Yarı yapışık Hayır (S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11 Schneider’ın medya+ + % 10 FCS KC hatları (Kc167, Kc7E10)21,22 M3 + BPYE + % 5 FCS, pH 6,6 Yarı yapışık Hayır Hyclone-CCM3, pH 6.2 Imaginal disk ve CNS çizgiler (ML-çizgiler)13,14 M3 + BPYE + % 10 FCS, pH 6,6 Yarı yapışık Hayır 10 µg/mL insülin Milner Imaginal disk (CME-satır)15 hatları M3 + % 2 FCS Yarı yapışık Hayır 5 µg/mL insülin % 2.5 sinek özü fGS/OSS16 M3 + % 10 FCS, pH 6.8 Yapışık * 10 µg/mL insülin 1 mg/mL C5H8KNO4   0,5 mg/mL KHCO3  0.6 mg/mL glutatyon % 10 sinek özü RASV12 hatları18 M3 + BPYE + % 10 FCS, pH 6,6 Yapışık Evet Tablo 1: Çeşitli özellikleri ve ortam şartları Drosophila hücre hatları. Yarı yapisan Schneider satırlarının S2R + S2-Drosophila RNAi eleme Merkezi (DRSC), S2-Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) ve Sg4 de dahil olmak üzere farklı yalıtır sağlam ne zaman M3 medyada kültürlü çoğalırlar sık kullanılan hücre satır olduğunu + Bactopetone Maya özü (BPYE) % 10 fetal buzağı serum (FCS) ile desteklenmiştir. Alternatif olarak, Schneider’ın medya (pH 6.7-6.8) genellikle M3 + BPYE yerine kullanılır. Kc satırları çoğalırlar M3 + BPYE (%5 FCS) veya serum-Alerjik CCM3 medya. ML Imaginal disk ve merkezi sinir sistemi (MSS) satırları insülin takviyesi yayılması için gerektirir. Milner Imaginal disk çizgiler takviyesi insülin ve sinek ayıklamak gerektirir. Yapisan fGS/OSS hücre hatları büyümesi için insülin, sinek özü gibi glutatyon daha yüksek bir konsantrasyon gerektirir. Yapisan RasV12 satırları büyümek de M3 + BPYE (% 10 FCS). Tripsin yapisan hücre hatları büyüme yüzeyinden çıkarmak için kullanılır. Hücre satırı (stok #) Genotip Saat (h) iki katına * Doku kaynağı S2R + (150) Örer 39 Geç embriyolar S2-DGRC (6) Örer 23 Geç embriyolar S2-DRSC (181) Örer 46 Geç embriyolar Kc167 (1) e/se 22 6−12 s embriyolar ML-BG2-c2 (53) y v f mal 48 3rd INSTAR larva CNS ML-BG3-c2 (68) y v f mal 104 3rd INSTAR larva CNS ML-DmD8 (92) y v f mal 66 3rd INSTAR larva kanat disk CME W1 Cl.8+ (151) Örer 46 3rd INSTAR larva kanat disk CME L1 (156) Örer 47 3rd INSTAR larva bacak disk OSS (190) bamD86 45 Yetişkin bam mutant yumurtalık RASV12 satırları UAS-GFP; P(UAS-Ras85D.v12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 41−65 Embriyo Tablo 2: Genotip, zaman ve doku kaynakları yaygın olarak iki katına kullanılan Drosophila hücre hatları. Doku genotip, kaynak ve yaygın olarak kullanılan hücre satırları saati değerini iki katına nüfus sunulmaktadır. 25 ° C’de önerilen medya büyüme zaman iki katına temel Kültür gemi Medya (mL) hacmi 12,5 cm2 T-flask 2.5 25 cm2 T-flask 5 75 cm2 T-flask 15 35 mm plaka 1 60 mm plaka 4 100 mm plaka 10 384-şey plaka * 0,04/iyi 96-şey plaka * 0,1/iyi 48-şey plaka * 0.3/iyi 24-şey plaka * 0,5/iyi 12-şey plaka 1.0/iyi 6-şey plaka 2.0/iyi Tablo 3: Kültür gemiler ve önerilen ortam birimleri. Kültür damarları irili ufaklı Drosophila hücre kültürü çalışmalarının için kullanılabilir. Uygun ortam birimleri (mL) her araç için tavsiye edilir. Hücre süspansiyon ile parafin film medya kaybı buharlaşma nedeniyle azaltmak için daha az 0.5 mL içeren çok iyi plakalarının. Birim M3 + BPYE, pH 6,6 70 mL Isı FCS inaktive 20 mL Steril süzülmüş DMSO * 10 mL Tablo 4: 100 mL (M3 + BPYE, % 20 FCS, % 10 DMSO) dondurma ortamının hazırlanması için reçete. Gerektiği gibi dondurma ortam hazırlamak ve uzun süre DMSO içeren dondurucu ortamları saklama kaçının. M3 + BPYE orta Tutar Kalkanlar ve seslendirdi’nın M323 1 şişe KHCO3 0,5 g Seçme Maya ekstresi 1.0 g Bactopeptone 2.5 g Steril arıtılmış su 1000 mL Tablo 5: 1 L M3 + BPYE hazırlanması için reçete doku kültürü orta. PH 6,6 için ayarlayın. Orta 0,22 µm filtreden geçirilerek sterilize. FGS/OSS hücre satırı için temel M3 orta Tutar Kalkanlar ve M3 şarkı söyledi 1 şişe KHCO3 0,5 g C5H8KNO4   1.0 g Steril arıtılmış su 1000 mL Tablo 6: 1 L fGS/OSS M3 temel orta tarifini. PH 6.8 için ayarlayın. Orta 0,22 µm filtreden geçirilerek sterilize. Hyclone-CCM3 Tutar CCM3 toz 28,6 g NaHCO3 0.35 g 10 N NaOH 2.5 mL CaCl2 0,5 g Steril arıtılmış su 1000 mL Tablo 7: Hyclone-CCM3 doku kültürü orta 1 L tarifini. PH 6.2 için ayarlayın. Orta 0,22 µm filtreden geçirilerek sterilize. M3 + BPYE + % 10 FCS Miyake disk ve CNS hatları orta Milner disk hatları orta fGS/OSS tam orta M3 + BPYE, pH 6,6 90 mL 90 mL – – Isı FCS * inaktive 10 mL 10 mL 2 mL 10 mL İnsülin (10 mg/mL) – 100 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Sinek özü – – 2.5 mL 10 mL Glutatyon (60 mg/mL) – – 1 mL M3, pH 6,6 – – 97,5 mL – fGS/OSS M3, pH 6.8 – – 79 mL Tablo 8: Çeşitli ortak 100 mL hazırlanması için reçete Drosophila hücre kültür medya. 56 ° c için 1 h FCS kuluçkaya ve Kompleman proteinleri ısı devre dışı için beş dakikada sallayın.

Discussion

Drosophila hücre kültürleri yüksek üretilen iş hücre tabanlı ekranlar için birincil reaktifler vardır. Bunların kullanımı aynı zamanda tamamlar içinde vivo genetik araştırma yanında-mek şartıyla hücrelerin biyokimya, sinekler, hücre biyolojisi, mikroskobu ve daha yakın zamanlarda genetik somatik hücre enjekte önce transgenik yapıları, test hızlı için uygun homojen bir nüfusa 1,2,3,8,9,10düzenleme genom tarafından manipülasyonlar.

Canlılık ve kurtarma donmuş Drosophila hücre düşük sıcaklıklarda dahi şiddetli dalgalanmalara hassas. DGRC N2 (-196 ° C) sıvı faz donmuş hücre satırlarını depolar ve onları kuru buz (-78.5 ° C) taşır. Kuru buzun içinde taşınan donmuş ampul geri sıvı N2 veya depolama için bir-80 ° C dondurucu içine aktarılmamalıdır. Bunun yerine, donmuş hücreleri olmalı çözdürülen, yüksek hücre yoğunluğu en kısa zamanda girişte (iletişim kuralı Bölüm 1) adlı reseeded ve onların Hedeflenen Amaçlar (iletişim kuralı Bölüm 3) için kültürlü. Hücre hatları hemen deneyler için kullanılmaz, kullanıma hazır olana satırları olmalıdır hücre (iletişim kuralı Bölüm 6) cryopreserved.

ML-BG2-c2 ve Ras hatları gibi bazı hücre hatları cryopreserved durumundan canlanan etkileri kurtarmak için birkaç güne ihtiyacım var. Hücresel enkaz önemli miktarda bu hücre satırları çözdürme sonra ilk birkaç gün eşlik eder. Rahatsız edilmeden yaptı, hücrelerin prolifere yeniden elde etmek ve. Birçok Drosophila hücre hatları DGRC M3 tabanlı medya22yılında büyümeye uyarlanmıştır. Çözdürme etkilerinden kurtarmak yavaş hücre satırlarını için şartına medya kullanımı yararlı olabilir. Klimalı ortamları olası kurtarma ve çözdürme sonra hücrelerin çoğalması teşvik medya içine hücreleri tarafından salgılanan büyüme faktörleri içerir.

Hücre hatları genellikle lag faz, üssel faz, plato faz ve bir bozulma faz oluşan bir klişeleşmiş büyüme eğrisi izleyin. Ne zaman onlar bir yoğunluğu 1 x 106 ila 1 x 107 hücre/mL 25 ° C’de, kültürlü kadar Drosophila hücre satır büyüme log fazı içinde prolifere Öyle ki her zaman üstel büyüme aşamasında olduklarını hücre hatları pasajlı ki esastır.

Yüzde olarak ifade edilen bir kültür, izdiham hücreleri tarafından kaplıdır büyüme yüzey alanı açıklar. Hücre izdiham bir hücre satırı için hücre şekli ve boyutu bağlıdır. Farklı hücre satır türleri farklı morfoloji ve bağlılık özellikleri var. Sonuç olarak, farklı hücre hatları yaklaşık benzer izdiham, büyük ölçüde farklı hücre yoğunluğu (şekil 1) olabilir. Kültür izdiham Drosophila hücre hatları bile büyüme yüzey edildikten sonra bir başka üstüne kazık foci olarak mı yoksa süspansiyon tarafından çoğalırlar devam etmesi Drosophila hücre kültürleri passaging için ideal bir göstergesi olmayabilir kapalı (şekil 1). Ancak, kullanıcılar belirli hücre hatları ile deneyimli kez izdiham için hızlı görsel bir kılavuz olarak için alt kültür zaman kullanabilir.

O 19−25 ° C arasında ortam RT Drosophila çizgilere büyümek mümkün olmakla birlikte, ortam sıcaklığı dalgalanmalar nükleer silahların yayılmasına karşı kurunu etkileyebilir çünkü önerilmez. Bir adanmış 25 ° C kuluçka kullanılması önerilir. Kuluçka makinesi Drosophila hücre kültürleri için arabelleğe almak için CO2 Drosophila hücre kültür medya kullanmayın çünkü CO2 gaz alışverişini kolaylaştırmak gerekmez. Hücre hatları kültür için kuluçka makinesi içinde nem plakaları hücrelerde kültür zaman gözden değil için önemli bir faktördür. Kuluçka makinesi ve çalışma ortamı türüne bağlı olarak, kuluçka makinesi içinde steril su kabı yerleştirmek için gerekli olabilir. Medya buharlaşma en aza indirmek için kapalı T-flask kullanın veya kültür plakaları sıkıca kapalı bir plastik konteyner kombine kuluçka makinesi iken içinde saklayın.

Drosophila hücre hatları subculturing için bir program geliştirmek önemlidir. Büyüme oranı ve monitör tutarlılık tahmin etmek için bu alt kültür bile geometrik bir oranında (oranı split 1:2, 1:4, 1:8) için uygundur. Örneğin, bir 10 mL Konfluent tabak Kc167 hücre 8 x 106 hücre/mL, 1 x 106 hücre/mL (1,25 mL taze medya 8,75 mL sulandırılmış hücre süspansiyon) tohumlama yoğunluğu elde etmek için 1:8 oranında bölebilirsiniz. 72 saat içinde Kc167 kültürler 24 h katlama zaman verilen 8 x 106 hücre/mL, bir yoğunluk için çoğalırlar bekleniyor. Split oranı bu nedenle hücreleri her zaman onların büyüme üstel günlük aşamasında kültürlü sağlanması bir uygun alt kültür rutin kadar haftada iki kez, kolaylaştırmak için belirlenir. Bu ne çok kısa ne de çok uzun zaman izdiham için böylece hücreleri subculturing düzenli bir zamanlama sağlar. İzdiham zaman çok kısa ise, hücreleri bir alt hücre yoğunluğuna (daha yüksek split oranı) subcultured. Benzer şekilde, izdiham ulaşmak için zaman çok uzun ise, hücreleri daha yüksek bir hücre yoğunluğuna (alt bölme oranı) subcultured. Çoğu Drosophila hücre satırlarının düşük hücre yoğunluğu için çok hassas olduğunu unutmamak gerekir (< 1 x 105 hücre/mL), hangi hücrelerin pek çoğalırlar ve sonunda ölebilir.

Drosophila hücre hatları büyüme özellikleri ve Morfoloji değişir. Sonuç olarak, hücre hatları farklı özelliklere sahip farklı şekilde ele alınması gerekebilir. Çoğu Drosophila hücre hatları yarı yapisan vardır. Alt hücre yoğunluğu, onlar daha güçlü büyüme yüzeye bağlı kalmak ve kültür Konfluent hale geldikçe, hücreler daha az yapışık olmak ve kolayca ayırmak. Sadece onları çıkarmak için hücre monolayer medya dağıtmak operatör sağlar gibi hücre bağlılık bu dereceli değişim kolay subculturing en çok kullanılan Drosophila hücre hatları (Schneider, Kc çizgiler, Imaginal disk ve CNS satırları) kolaylaştırır Kültür yoğun olduğunda büyüme yüzeyden. Yüzey yapışık gibi satırları için kadın mikrop-line kök/yumurtalık somatik kılıf (fGS/OSS) ve Ras çizgiler, tripsin büyüme yüzey hücreleri ayırma yardım etmek kısa bir süre için hücrelerde kuluçkaya için gerekli olduğunu.

Medya eklemeleri için çoğu Drosophila hücre hatları fetal buzağı serum (FCS) içerir. İnsülin ve yetişkin sinek özü (FEX) bazı belirli satırları için gereklidir. FEX tanımsız bileşenleri belirli larva Imaginal disk yetişkin yumurtalık hücre satırları ve büyüme için gerekli içerir. DGRC hazırlar ve yapar kullanılabilir yetişkin FEX elde edilen 1 haftalık Oregon-R-modENCODE sinekler (RRID: BDSC_25211) 2.5 mL ve 10 mL aliquots içinde. DGRC de küçük ölçekli FEX hazırlık için yönergeler kendi web sitesinde sağlar. . FEX hazırlık, ancak, zaman alıcı ve yetişkin sinekler büyük miktarda gerektirir.

Drosophila hücre satırları dondurma zaman ve hücre hatları bakım Kimyasalları hemen kullanılmıyor olarak kaydeder. Dondurma yavaş yavaş hücreleri (-1 ° C/dak) dondurarak-80 ° c DMSO, bir cryoprotective ajan içeren bir ortamda elde edilir. Yavaş soğutma başarılı dondurma için kritik bir adımdır. -80 ° C dondurucuya hücre ampul-1 ° C/dk isopropanol ile dolu bir dondurma konteyner yerleştirildiğinde bir hızda soğutulur. 25 ° C ortam sıcaklığında başlayarak, o-ecek almak en fazla 2 saat-80 ° C. ulaşmak için ampul sıcaklığı için Bir gecede donarak ampul bırakmanız önerilir.

Donmuş ampul hızla uzun süreli depolama için azot sıvı fazına aktarılmalıdır. Ortam sıcaklığında cryovial hızla yaklaşık 10 ° C/dak Isıtınız ve canlılığı,-50 ° C23tehlikeye girer. Transfer hızlı tutmak için ampul maruz kalma ortam sıcaklığı en aza indirmek için küçük gruplar halinde ele. Alternatif olarak, donmuş cryovials sıvı N içine transfer için hazırlarken kuru Buza koyun2. Sıvı azot yoksa, hücreleri rağmen zaman içinde önemli bozulma riski ile-80 ° C dondurucuda saklanabilir.

Hücre yoğunluğu başarılı dondurma ve hücre hatları izleyen bir canlanma için önemlidir. Genel olarak, yeni hücre satırları ilk oluşturmak için dondurulmuş Dondur (1−3 ampul) hücrelerinin aşırı kullanılabilir duruma gelir gelmez. Hücre kültürünü daha stabil kültürlü bir kez 10−20 ampul donmuş stokunun oluşturulması gerekir. Bu hisse senedi sonra onun sonrası donma hücre kurtarma ve canlılığı, sonra Hollow’a için dağıtılır olup olmadığını denetlemek için veya dondurulmuş hisse senedi ampul sayısı beş düştüğünde hisse senedi yerine çözdürülen. Son olarak, çözdürülen hücreleri hücre hatları3,24gelişmeye bilinmektedir onun ebeveyn hisse senedi özellikleri saklamanız doğrulanması önemlidir.

Sonuç olarak, bu yazı çeşitli çizgiler, en iyi yöntemler ve görsel-işitsel iletişim kuralları üzerinde Drosophila hücre satırlarını temel kullanımı için temel bilgileri sağlayarak Drosophila hücre kültürleri ile çalışmak için bir astar sunar. Bu erişilebilir kaynak sorunsuz kültürlü Drosophila hücreleri ile çalışmaya giriş kolaylaştırmak için ve herhangi bir araştırma laboratuvarı mevcut Eğitim Kılavuzları tamamlayacak anlamına da gelmektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz ulusal sağlık Enstitüleri (Ödülü NIH P40OD010949) ve araştırma topluluğu DGRC küratörlüğünü çeşitli D. melanogaster DNA/vektör/hücre kaynakları kullanmak için teşekkür ederiz.

Materials

100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).
  2. Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
  3. Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
  4. Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
  5. Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
  6. Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
  7. Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
  8. Echalier, G. . Drosophila Cells in Culture. , (1997).
  9. Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. . Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).
  10. Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. . Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).
  11. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
  12. Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
  13. Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
  14. Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
  15. Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
  16. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
  17. Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
  18. Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
  19. Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
  20. Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
  21. Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
  22. Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
  23. Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).
  24. Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).

Tags

Drosophila Cell LinesThawingCulturingCryopreservingCell CultureCell SuspensionCell DensityCell ProliferationCell ViabilityCell MorphologyLaminar Flow HoodCell Culture MediaCentrifugationCell PassageMicroorganismal Contamination

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image