Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil
Summary
Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.
Abstract
Organizmalarda hücresel fenotipleri ifade etmek için, yaşam hücreleri buna göre gen ifadesi yürütmek, ve transkripsiyon programları gen ifadesinde merkezi bir rol oynamaktadır. Hücresel transkripsiyonel makine ve kromatin modifikasyon proteinleri transkripsiyon düzenleyen koordine. Moleküler düzeyde transkripsiyon düzenlemesi analiz etmek için, elektroforetik hareketlilik vardiya, geçici muhabir ve kromatin immünopetürasyon (çip) gibi çeşitli deneysel yöntemler mevcuttur. Biz doğrudan histon modifikasyonları ve hücrelerde protein ve DNA arasındaki etkileşimleri gösteren avantajları nedeniyle bu makalede ayrıntılı olarak değiştirilmiş bir çip tahlil tarif. Başarılı bir ChIP tahlil önemli adımlardan biri kromatin kesme olduğunu. Sonication genellikle kromatin kesme için kullanılan olsa da, tekrarlanabilir koşulları belirlemek zordur. Yerine sonication tarafından kromatin kesme, biz mikrococcal nükleaz ile enzimatik sindirim kullanılmıştır (mnase) daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için. Bu yazıda MNase kullanarak basit bir ChIP assay Protokolü sağlıyoruz.
Introduction
Memelinin hücrelerinde gen ifadesi sıkıca ve dinamik olarak düzenlenir ve transkripsiyon önemli adımlardan biridir. Gen transkripsiyon ağırlıklı olarak transkripsiyon faktörleri ve Histonlar tarafından düzenlenir. Transkripsiyon faktörü belirli DNA dizileri bağlayan ve Gen transkripsiyonu kontrol eden bir proteindir. Bu faktörler ya teşvik veya RNA polimeraz II (polıı), bir şablon1olarak genomik DNA mRNA sentezini Başlatan işe inhibe. Histon kuyruk kalıntılarının asetilasyon ve metilasyonu gibi histon değişimleri, kromatin yapısını değiştirerek Gen transkripsiyonu olumlu ve olumsuz yönde etkiler2. Gen ifadesinde yapılan değişiklikler hücresel içeriği etkilediği için, transkripsiyon tarafından düzenlenmiş moleküler mekanizmaları incelemek önemlidir.
Bugüne kadar, gen transkripsiyon düzenlenmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. Elektroforetik hareketlilik vardiya tahlil (EMSA), aynı zamanda bir jel vardiya tahlil olarak adlandırılan, bir protein-DNA etkileşimi analiz etmek için kullanılır3. Bir nükleer ekstresi, ilgi hücrelerinden bir radyoaktif izotopu (örneğin, 32P) ile inkübe edilir-etiketli DNA prob ve bir polyacrylamid jel üzerinde elektroforesed. Autoradiogram, DNA-protein kompleksinin bir jeldeki Probtan daha yavaş olduğunu gösteriyor. Proteine karşı bir antikor varlığında, DNA-protein-antikor kompleksi bir jel içinde DNA-protein kompleksinden daha yavaş bir şekilde göç eder. Bu süper kaymalı bant DNA ve protein arasındaki belirli bağı ortaya çıkarır. Ancak, EMSA sadece hücre içermeyen bir sistemde belirli bir DNA-protein etkileşimi belirler ve bu nedenle etkileşim yaşam hücrelerinde transkripsiyon kontrol olup olmadığını bilinmeyen kalır. Geçici muhabir tahlil, yaygın Lusiferaz muhabir tahlil denilen, hücrelerde gen ifade düzenleme adresi için geliştirilmiştir. Tipik olarak, bir faiz geni bir upstream genomik bölge bir muhabir Plasmid içine eklenir, geçmeli hücrelere transfekte, ve muhabir aktivite ölçülür. Çeşitli silme mutantları, gen düzenlemeden sorumlu bölgelerin tanımlanması sağlar. Bir muhabir tahlil transkripsiyon faktörleri ve bağlayıcı DNA dizileri transkripsiyon kontrol tanımlamak için yararlı bir araçtır olsa bile, bu yöntem bir gazeteci plazmid kromatin yapısının ücretsiz ve “gerçek” yansıtmaz büyük bir dezavantajı vardır Transkripsiyon makineleri. Buna ek olarak, histon değişikliklerinin değişiklikleri sistem tarafından belirlenemez.
Kromatin immünoprecipitation (çip) yönteminin gelişimi Jackson ve chalkley ‘nin raporlarına dayalı olarak “tüm hücre” formaldehit ile sabitleme kromatin yapısı4,5. O zamandan beri, birçok ilgili teknikler geliştirilmiştir ve geliştirilmiş6. Çip testinde hücreler formaldehit ile çapraz bağlantı DNA ve proteinleri ile sabitlenir. Kromatin parçalanmış ve sonra ilgi antikorları ile immunoprecip,. Bağışıklık kompleksi yıkanır ve DNA ‘Yı arındırılır. Genomun belirli bir bölgeye hedeflenen astar ile PCR amplifikasyon genom ilgi proteinlerin doluluk ortaya çıkarır.
Çip, transkripsiyon faktörleri ve değiştirilmiş Histonlar gibi proteinlerin DNA ile etkileşimlerini belirlemek için güçlü bir araçtır, ancak uygulamada kromatin parçalanma adımı gibi bazı zorluklar vardır. Sonication yaygın kromatin parçalama için kullanılır; Ancak, tekrarlanabilir koşulları belirlemek için hantal. Micrococcal nükleaz (mnase) tedavisi kromatin kesme için alternatif bir yöntemdir. MNase çift telli, tek telli, dairesel ve doğrusal DNA ve RNA ‘yı özleyen bir Endo-exonuclease. Optimum kromatin parçalanma için Kromatin ve enzim, sıcaklık ve inkübasyon süresi miktarları da dahil olmak üzere koşulları belirlemek nispeten kolaydır. Mevcut protokolleri değiştirdi ve basitleştirdik ve basit ve tekrarlanabilir bir yöntem kurduk. Bu yazıda, memelinin hücrelerinde MNase kullanan bir ChIP tahlil Protokolü sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonication yaygın olarak parçalanmış kromatin elde etmek için kullanılan olsa da, zaman alıcı ve tekrarlanabilir koşulları tanımlamak için hantal. Bu protokolde, enzimin sindiriminin yeniden üretilebilen koşulları tespit etmek daha kolay olması gerektiğinden MNase sindirimi kullandık. MNase sindirim sonra kısa bir sonication adım (bkz: adım 2,2) hücre membranı kırmak ve sindirilmiş Kromatin serbest bırakmak için gerekli oldu. Bu nedenle, bizim protokolünde sonication güç mümkün olduğunca …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Genentech telif tarafından umut şehri ‘ne desteklenmektedir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından tamamen veya kısmen desteklenmemektedir.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
