Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana
Summary
L’immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell’ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.
Abstract
Per esprimere i fenotipi cellulari negli organismi, le cellule viventi eseguono l’espressione genica di conseguenza e i programmi trascrizionali svolgono un ruolo centrale nell’espressione genica. Il macchinario trascrittorio cellulare e le sue proteine di modificazione della cromatina si coordinano per regolare la trascrizione. Per analizzare la regolazione trascrizionale a livello molecolare, sono disponibili diversi metodi sperimentali come lo spostamento della mobilità elettroforetica, i saggi di immunoprecipitazioni transitori e cromatina (ChIP). Descriviamo un saggio ChIP modificato in dettaglio in questo articolo a causa dei suoi vantaggi nel mostrare direttamente le modifiche degli istoni e le interazioni tra proteine e DNA nelle cellule. Uno dei passi chiave di un saggio ChIP di successo è la tosatura della cromatina. Anche se la sonicazione è comunemente usata per la tosatura della cromatina, è difficile identificare le condizioni riproducibili. Invece di tosare la cromatina mediante sonicazione, abbiamo utilizzato la digestione enzimatica con nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere risultati più riproducibili. In questo articolo viene fornito un semplice protocollo ChIP assay usando MNase.
Introduction
L’espressione genica nelle cellule dei mammiferi è regolata in modo stretto e dinamico, e la trascrizione è uno dei passi chiave. La trascrizione genica è regolata principalmente da fattori di trascrizione e istoni. Un fattore di trascrizione è una proteina che si lega a specifiche sequenze di DNA e controlla la trascrizione genica. Questi fattori promuovono o inibiscono il reclutamento di RNA polimerasi II (PolII), che avvia la sintesi di mRNA dal DNA genomico come modello1. Le modifiche istonicome l’acetilazione e la metilazione dei residui della coda istone irto influenzano positivamente e negativamente la trascrizione genica cambiando la struttura della cromatina2. Poiché le alterazioni nell’espressione genica influenzano il contesto cellulare, è essenziale esaminare i meccanismi molecolari con cui la trascrizione è regolata.
Ad oggi, sono disponibili diversi metodi per studiare la regolazione della trascrizione genica. L’analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del cambio di gel, viene utilizzato per analizzare un’interazione proteina-DNA3. Un estratto nucleare proveniente da cellule di interesse viene incubato con una sonda di DNA con etichettatura isotoma radioattiva (ad esempio, 32P) ed elettroforise su un gel poliacrilammide. Il suo autoradiogramma mostra che il complesso DNA-proteinmi migra più lentamente della sonda in un gel. In presenza di un anticorpo contro la proteina, il complesso DNA-protein-anticorpo migra in un gel più lentamente del complesso DNA-protein. Questa banda supershiftata rivela un legame specifico tra il DNA e la proteina. Tuttavia, EMSA determina solo una specifica interazione DNA-proteina in un sistema privo di cellule, e quindi rimane sconosciuto se l’interazione controlla la trascrizione nelle cellule viventi. Il saggio transitorio del reporter, comunemente chiamato luciferasi reporter assay, è stato sviluppato per affrontare la regolazione dell’espressione genica nelle cellule. Tipicamente, una regione genomica a monte di un gene di interesse viene inserita in un plasmide reporter, trascinata transitoriamente in cellule e viene misurata l’attività del reporter. Una varietà di mutanti delezione consente l’identificazione delle regioni che sono responsabili della regolazione genica. Anche se un saggio reporter è uno strumento utile per identificare i fattori di trascrizione e rilegare le sequenze di DNA che controllano la trascrizione, questo metodo ha un grave svantaggio in quanto un plasmide reporter è privo di struttura cromatica e non riflette “reale” macchinari per la trascrizione. Inoltre, le modifiche ai istoni non possono essere determinate dal sistema.
Lo sviluppo del metodo di immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP) si è basato sui rapporti di Jackson e Chalkley che la fissazione “intera cellula” con formaldeide conservava la struttura della cromatina4,5. Da allora, molte tecniche correlate sono state sviluppate e migliorate6. Nei saggi ChIP, le cellule sono fissate con formaldeide per collegare in modo incrociato DNA e proteine. La cromatina viene frammentata e quindi immunoprecipitata con anticorpi di interesse. Il complesso immunitario viene lavato e il DNA viene purificato. L’amplificazione PCR con primer destinati a una particolare regione del genoma rivela l’occupazione di proteine di interesse nel genoma.
Anche se ChIP è un potente strumento per identificare le interazioni di proteine come fattori di trascrizione e istoni modificati con il DNA, il metodo comporta alcune difficoltà, come una fase di frammentazione della cromatina, in pratica. La Sonicazione è stata ampiamente utilizzata per la tosatura della cromatina; tuttavia, è ingombrante identificare le condizioni riproducibili. Il trattamento nucleale micrococcale (MNase) è un metodo alternativo per la tosatura della cromatina. MNase è un endo-exonuclease che digerisce DNA e RNA a doppio filamento, a filamento singolo, circolare e lineare. È relativamente facile determinare le condizioni, comprese le quantità di cromatina e enzima, temperatura e tempo di incubazione, per la frammentazione ottimale della cromatina. Abbiamo modificato e semplificato i protocolli esistenti e abbiamo stabilito un metodo semplice e riproducibile. Questo documento fornisce il protocollo per un saggio ChIP che utilizza MNase nelle cellule dei mammiferi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se la sonicazione è comunemente usata per ottenere la cromatina frammentata, è dispendioso in termini di tempo e ingombrante identificare le condizioni riproducibili. In questo protocollo, abbiamo usato la digestione di MNase perché la digestione degli enzimi dovrebbe essere più facile identificare le condizioni riproducibili. Un breve passo di sonicazione dopo la digestione di MNase (vedi passo 2.2) è stato necessario per rompere la membrana cellulare e rilasciare la cromatina digerita. Pertanto, la potenza d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è supportata dalle royalties Genentech per City of Hope. Questo lavoro non è supportato in tutto o in parte dai National Institutes of Health.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
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