Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

A expressão gênica em células de mamíferos é regulada firmemente e dinamicamente, e a transcrição é uma das etapas-chave. A transcrição gênica é regulada principalmente por fatores de transcrição e histonas. Um fator de transcrição é uma proteína que se liga a sequências específicas de DNA e controla a transcrição genética. Estes fatores promovem ou inibem o recrutamento do RNA polymerase II (PolII), que inicia a síntese de mRNA do ADN genomic como um molde¹. As modificações da histona tais como a acetilação e a metilação de resíduos da cauda de histona afetam positivamente e negativamente a transcrição do gene alterando a estrutura da cromatina². Como as alterações na expressão gênica afetam o contexto celular, é essencial examinar os mecanismos moleculares pelos quais a transcrição é regulada.

Até o momento, vários métodos para investigar a regulação da transcrição genética estão disponíveis. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), também denominado ensaio de mudança de gel, é usado para analisar uma interação proteína-DNA³. Um extrato nuclear de células de interesse é incubado com um isótopo radioativo (por exemplo, ³²P)-sonda de DNA rotulada e electrophoresed em um gel de poliacrilamida. Seu autoradiograma mostra que o complexo DNA-proteína migra mais lentamente do que a sonda em um gel. Na presença de um anticorpo contra a proteína, o complexo DNA-proteína-anticorpo migra em um gel mais lentamente do que o complexo DNA-proteico. Esta banda superdeslocada revela ligação específica entre o DNA e a proteína. No entanto, a EMSA só determina uma interação DNA-proteína específica em um sistema livre de células e, portanto, permanece desconhecida se a interação controla a transcrição em células vivas. O ensaio transiente do repórter, chamado geralmente o ensaio do repórter do luciferase, foi desenvolvido para endereçar o Regulamento da expressão de gene nas pilhas. Tipicamente, uma região genomic ascendente de um gene do interesse é inserida em um plasmídeo do repórter, transfected transiente nas pilhas, e a atividade do repórter é medida. Uma variedade de mutantes do apagamento permite a identificação das regiões que são responsáveis para a regulação do gene. Mesmo que um ensaio de repórter é uma ferramenta útil para a identificação de fatores de transcrição e seqüências de DNA de ligação controlando a transcrição, este método tem uma grande desvantagem em que um plasmídeo repórter está livre de estrutura cromatina e não reflete “real” máquinas de transcrição. Além disso, as alterações nas modificações de histona não podem ser determinadas pelo sistema.

O desenvolvimento do método da imunoprecipitação da cromatina (microplaqueta) foi baseado em relatórios de Jackson e de Chalkley que a fixação da “pilha inteira” com o formaldehyde preservou a estrutura da cromatina^4,5. Desde então, muitas técnicas relacionadas foram desenvolvidas e melhoradas⁶. Em ensaios de ChIP, as células são fixadas com formaldeído para cross-link DNA e proteínas. A cromatina é fragmentada e, em seguida, imunoprecipitado com anticorpos de interesse. O complexo imunológico é lavado, e o DNA é purificado. A amplificação de PCR com iniciadores direcionados a uma determinada região do genoma revela a ocupação de proteínas de interesse no genoma.

Embora o ChIP seja uma ferramenta poderosa para identificar as interações de proteínas como fatores de transcrição e histonas modificadas com DNA, o método envolve algumas dificuldades, como uma etapa de fragmentação da cromatina, na prática. Sonication tem sido amplamente utilizado para a cromatina de corte; no entanto, é complicado identificar condições reprodutíveis. O tratamento micrococcal do nuclease (MNase) é um método alternativo para o corte da cromatina. MNase é um Endo-exonuclease que digere duplo-encalhado, único-encalhado, o ADN circular e linear e o RNA. É relativamente fácil determinar as condições, incluindo as quantidades de cromatina e enzima, temperatura e tempo de incubação, para uma melhor fragmentação da cromatina. Modificamos e simplificamos os protocolos existentes, e estabelecemos um método simples e reprodutível. Este papel fornece o protocolo para um ensaio da microplaqueta usando MNase em pilhas de mamíferos.