Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen
Summary
Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.
Abstract
Om cellulaire fenotypes in organismen te uiten, voeren levende cellen de genexpressie dienovereenkomstig uit, en transcriptionele Programma’s spelen een centrale rol in genexpressie. De cellulaire transcriptionele machines en de chromatine modificatie eiwitten coördineren om transcriptie te reguleren. Om transcriptionele regulering op moleculair niveau te analyseren, zijn verschillende experimentele methoden beschikbaar, zoals elektroforetisch mobiliteits verschuiving, voorbijgaande reporter en Chromatine-immunoprecipitatie (chip)-assays. In dit artikel beschrijven we een gemodificeerde ChIP assay in detail vanwege de voordelen van het direct tonen van Histon-modificaties en de interacties tussen eiwitten en DNA in cellen. Een van de belangrijkste stappen in een succesvolle ChIP assay is chromatine schuintrekken. Hoewel sonicatie vaak wordt gebruikt voor het scheren van chromatin, is het moeilijk om reproduceerbare omstandigheden te identificeren. In plaats van het scheren van chromatine door sonicatie, gebruikten we enzymatische spijsvertering met micrococcal Nuclease (MNase) om meer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. In dit artikel bieden we een eenvoudig ChIP assay protocol met behulp van MNase.
Introduction
Genexpressie in zoogdiercellen is strak en dynamisch gereguleerd, en transcriptie is een van de belangrijkste stappen. Gentranscriptie wordt voornamelijk gereguleerd door transcriptiefactoren en histonen. Een transcriptiefactor is een eiwit dat zich bindt aan specifieke DNA-sequenties en Gene transcriptie regelt. Deze factoren bevorderen of remmen de werving van RNA polymerase II (PolII), waarbij mRNA-synthese van genomisch DNA als sjabloon1initieert. Histon-modificaties zoals acetylering en methylatie van Histon-staart resten positief en negatief beïnvloeden gentranscriptie door het veranderen van de chromatine structuur2. Aangezien veranderingen in genexpressie de cellulaire context beïnvloeden, is het essentieel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken waarmee transcriptie wordt gereguleerd.
Tot op heden zijn er verschillende methoden beschikbaar voor het onderzoeken van de regulering van gentranscriptie. Electrophoretic Mobility Shift assay (EMSA), ook wel een gel-Shift-test genoemd, wordt gebruikt voor het analyseren van een eiwit-DNA-interactie3. Een nucleair extract van belang cellen wordt geïnfiltreerd met een radioactieve isotoop (bijvoorbeeld 32P)-GELABELDE DNA-sonde en elektroforesed op een polyacrylamidegel. Het autoradiogram laat zien dat het DNA-eiwit complex langzamer migreert dan de sonde in een gel. In aanwezigheid van een antilichaam tegen het eiwit, migreert het DNA-eiwit-antilichaam complex in een gel langzamer dan het DNA-eiwit complex. Deze oververschoven band onthult een specifieke binding tussen DNA en eiwitten. Echter, EMSA bepaalt alleen een specifieke DNA-eiwit interactie in een cel-vrij systeem, en daarom blijft het onbekend of de interactie besturingselementen transcriptie in levende cellen. De Transient reporter Assay, ook wel bekend als plaats reporter Assay, werd ontwikkeld om genexpressie regulatie in cellen aan te pakken. Typisch, een upstream genomische regio van een gen van belang wordt ingevoegd in een verslaggever plasmide, transitief omgezet in cellen, en de reporter activiteit wordt gemeten. Een verscheidenheid aan deletie mutanten maakt het mogelijk om regio’s te identificeren die verantwoordelijk zijn voor genregulatie. Hoewel een reporter assay een nuttig hulpmiddel is voor het identificeren van transcriptiefactoren en bindende DNA-sequenties die transcriptie beheersen, heeft deze methode een groot nadeel doordat een reporter plasmide vrij is van chromatide structuur en niet “echt” weerspiegelt transcriptie machines. Bovendien kunnen wijzigingen in Histon-wijzigingen niet door het systeem worden bepaald.
De ontwikkeling van de Chromatine immunoprecipitatie (chip) methode was gebaseerd op de verslagen van Jackson en chalkley dat “hele cel” fixatie met formaldehyde geconserveerd chromatine structuur4,5. Sindsdien zijn veel verwante technieken ontwikkeld en verbeterd6. In ChIP testen worden cellen vastgezet met formaldehyde om DNA en eiwitten te dwars linken. De chromatine is gefragmenteerd en vervolgens immunoprecipitated met antilichamen van belang. Het Immuuncomplex wordt gewassen en het DNA wordt gezuiverd. PCR-versterking met primers gericht op een bepaalde regio van het genoom onthult de bezetting van eiwitten van belang in het genoom.
Hoewel ChIP een krachtig hulpmiddel is om de interacties van eiwitten zoals transcriptiefactoren en gemodificeerde histonen met DNA te identificeren, omvat de methode enkele moeilijkheden, zoals een chromatine-fragmentatie stap, in de praktijk. Sonicatie is op grote schaal gebruikt voor het schuintrekken van chromatine; het is echter omslachtig om reproduceerbare omstandigheden te identificeren. Micrococcal Nuclease (MNase) behandeling is een alternatieve methode voor chromatine scheren. MNase is een Endo-exonuclease dat dubbel gestrande, enkelvoudig, circulair en lineair DNA en RNA verteerd. Het is relatief eenvoudig om de voorwaarden te bepalen, met inbegrip van de hoeveelheden chromatine en enzym, temperatuur en incubatietijd, voor optimale chromatine fragmentatie. We hebben de bestaande protocollen aangepast en vereenvoudigd, en we hebben een eenvoudige en reproduceerbare methode vastgesteld. Dit artikel verschaft het protocol voor een ChIP assay met MNase in zoogdiercellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel sonicatie vaak wordt gebruikt om gefragmenteerde Chromatin te verkrijgen, is het tijdrovend en omslachtig om reproduceerbare omstandigheden te identificeren. In dit protocol gebruikten we MNase spijsvertering omdat enzym spijsvertering gemakkelijker reproduceerbare condities moet worden geïdentificeerd. Een korte ultrasoonapparaatstap na de spijsvertering van MNase (zie stap 2,2) was noodzakelijk om het celmembraan te breken en de verteerde Chromatin vrij te geven. Daarom moet de sonicatie-kracht in ons protocol …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek wordt ondersteund door Genentech royalty’s naar City of Hope. Dit werk wordt niet geheel of gedeeltelijk gesteund door de National Institutes of Health.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
