Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Die Genexpression in Säugetierzellen ist eng und dynamisch reguliert, und die Transkription ist einer der wichtigsten Schritte. Die Gentranskription wird hauptsächlich durch Transkriptionsfaktoren und Histonen reguliert. Ein Transkriptionsfaktor ist ein Protein, das an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und die Gentranskription steuert. Diese Faktoren fördern oder hemmen entweder die Rekrutierung von RNA-Polymerase II (PolII), die die mRNA-Synthese aus genomischer DNA als Vorlage¹initiiert. Histonmodifikationen wie Acetylierung und Methylierung von Histonschwanzrückständen wirken sich positiv und negativ auf die Gentranskription aus, indem sie die Chromatinstruktur ändern². Da Veränderungen der Genexpression den zellulären Kontext beeinflussen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die die Transkription reguliert wird.

Bis heute stehen mehrere Methoden zur Untersuchung der Regulierung der Gentranskription zur Verfügung. Elektrophoretic mobility shift assay (EMSA), auch Gel shift Assay genannt, wird zur Analyse einer Protein-DNA-Interaktion³verwendet. Ein Kernextrakt aus gefährdeten Zellen wird mit einem radioaktiven Isotop (z. B. ³²P)-markierten DNA-Sonde inkubiert und auf einem Polyacrylamidgel elektrophorisiert. Sein Autoradiogramm zeigt, dass der DNA-Protein-Komplex langsamer wandert als die Sonde in einem Gel. In Gegenwart eines Antikörpers gegen das Protein wandert der DNA-Protein-Antikörper-Komplex langsamer in ein Gel als der DNA-Protein-Komplex. Dieses superversetzte Band zeigt eine spezifische Bindung zwischen DNA und Protein. EMSA bestimmt jedoch nur eine spezifische DNA-Protein-Interaktion in einem zellfreien System, und daher bleibt unbekannt, ob die Interaktion die Transkription in lebenden Zellen steuert. Der transiente Reporter-Assay, gemeinhin als Luziferase-Reporter-Assay bezeichnet, wurde entwickelt, um die Genexpressionsregulation in Zellen zu thematisieren. Typischerweise wird eine vorgelagerte genomische Region eines Gens von Interesse in ein Reporterplasmid eingefügt, vorübergehend in Zellen transfiziert, und die Reporteraktivität wird gemessen. Eine Vielzahl von Deletionsmutanten ermöglicht die Identifizierung von Regionen, die für die Genregulation verantwortlich sind. Obwohl ein Reporter-Assay ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und zur Bindung von DNA-Sequenzen zur Steuerung der Transkription ist, hat diese Methode einen großen Nachteil, da ein Reporterplasmid frei von Chromatinstruktur ist und nicht “real” widerspiegelt. Transkriptionsmaschinen. Darüber hinaus können Änderungen an Histonmodifikationen nicht vom System bestimmt werden.

Die Entwicklung der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) Methode basierte auf Jackson und Chalkleys Berichten, dass “ganze Zelle” Fixierung mit Formaldehyd konserviertchromatin Struktur^4,5. Seitdem wurden viele verwandte Techniken entwickelt und verbessert⁶. In ChIP-Assays werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, um DNA und Proteine miteinander zu vernetzen. Das Chromatin wird fragmentiert und dann mit Antikörpern von Interesse immunpräzipiert. Der Immunkomplex wird gewaschen und die DNA gereinigt. Die PCR-Amplifikation mit Primern, die auf eine bestimmte Region des Genoms ausgerichtet sind, zeigt die Belegung von Proteinen, die für das Genom von Interesse sind.

Obwohl ChIP ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die Wechselwirkungen von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren und modifizierten Histonen mit DNA zu identifizieren, bringt die Methode einige Schwierigkeiten mit sich, wie z. B. einen Chromatinfragmentierungsschritt, in der Praxis. Beschallung wurde weit verbreitet für das Scheren von Chromatin verwendet; es ist jedoch umständlich, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. Die Mikrokokken-Nuklease (MNase) ist eine alternative Methode zum Chromatinscheren. MNase ist eine Endo-Exonuklease, die doppelsträngige, einsträngige, kreisförmige und lineare DNA und RNA verdaut. Es ist relativ einfach, die Bedingungen, einschließlich der Mengen an Chromatin und Enzym, Temperatur und Inkubationszeit, für eine optimale Chromatinfragmentierung zu bestimmen. Wir haben die bestehenden Protokolle modifiziert und vereinfacht und eine einfache und reproduzierbare Methode etabliert. Dieses Papier stellt das Protokoll für einen ChIP-Test mit MNase in Säugetierzellen bereit.