Summary

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Published: May 10, 2019
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Summary

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Abstract

Para expresar fenotipos celulares en los organismos, las células vivas ejecutan la expresión génica en consecuencia, y los programas transcripcionales desempeñan un papel central en la expresión génica. La maquinaria transcripcional celular y sus proteínas de modificación de cromatina se coordinan para regular la transcripción. Para analizar la regulación transcripcional a nivel molecular, están disponibles varios métodos experimentales como el cambio de movilidad electroforética, el reportero transitorio y los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Describimos un ensayo ChIP modificado en detalle en este artículo debido a sus ventajas en mostrar directamente las modificaciones de la histona y las interacciones entre las proteínas y el ADN en las células. Uno de los pasos clave en un ensayo ChIP exitoso es la cizalladura de cromatina. Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para el cizallamiento de cromatina, es difícil identificar condiciones reproducibles. En lugar de cizallar cromatina por sonicación, utilizamos digestión enzimática con nucleasa microcócica (MNase) para obtener resultados más reproducibles. En este artículo, proporcionamos un protocolo de ensayo ChIP sencillo usando MNase.

Introduction

La expresión génica en células de mamíferos está regulada de forma estricta y dinámica, y la transcripción es uno de los pasos clave. La transcripción genética está regulada principalmente por factores de transcripción y histonas. Un factor de transcripción es una proteína que se une a secuencias de ADN específicas y controla la transcripción genética. Estos factores promueven o inhiben el reclutamiento de ARN polimerasa II (PolII), que inicia la síntesis de ARNm a partir del ADN genómico como plantilla1. Las modificaciones histonas como la acetilación y la metilación de los residuos de la cola de histona afectan positiva y negativamente a la transcripción del gen cambiando la estructura de la cromatina2. Dado que las alteraciones en la expresión génica afectan al contexto celular, es esencial examinar los mecanismos moleculares por los cuales se regula la transcripción.

Hasta la fecha, se dispone de varios métodos para investigar la regulación de la transcripción genética. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), también llamado ensayo de cambio de gel, se utiliza para analizar una interacción proteína-ADN3. Un extracto nuclear de células de interés se incuba con una sonda de ADN con etiqueta de isótopo radiactivo (por ejemplo, 32P) y electroforesed en un gel de poliacrilamida. Su autoradiograma muestra que el complejo ADN-proteína migra más lentamente que la sonda en un gel. En presencia de un anticuerpo contra la proteína, el complejo ADN-proteína-anticuerpo migra en un gel más lentamente que el complejo DE proteínas de ADN. Esta banda superimprovisada revela una unión específica entre el ADN y la proteína. Sin embargo, EMSA sólo determina una interacción específica ADN-proteína en un sistema libre de células, y por lo tanto sigue siendo desconocido si la interacción controla la transcripción en células vivas. El ensayo transitorio del reportero, comúnmente llamado ensayo de reportero luciferasa, fue desarrollado para abordar la regulación de la expresión génica en las células. Por lo general, una región genómica ascendente de un genal de interés se inserta en un plásmido reportero, transfectó transitoriamente en las células, y se mide la actividad del reportero. Una variedad de mutantes de eliminación permite la identificación de las regiones que son responsables de la regulación genética. A pesar de que un ensayo de reportero es una herramienta útil para identificar factores de transcripción y unir secuencias de ADN que controlan la transcripción, este método tiene una desventaja importante en que un plásmido reportero está libre de estructura de cromatina y no refleja “real” maquinaria de transcripción. Además, el sistema no puede determinar los cambios en las modificaciones de histono.

El desarrollo del método de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se basó en los informes de Jackson y Chalkley de que la fijación de “células enteras” con la estructura de cromatina preservada con formaldehído4,5. Desde entonces, muchas técnicas relacionadas se han desarrollado y mejorado6. En los ensayos de ChIP, las células se fijan con formaldehido para cruzar el ADN y las proteínas. La cromatina se fragmenta y luego se inmunoprecia con anticuerpos de interés. El complejo inmunológico se lava y se purifica el ADN. La amplificación de PCR con imprimaciones dirigidas a una región particular del genoma revela la ocupación de proteínas de interés en el genoma.

Aunque ChIP es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de proteínas como factores de transcripción y histonas modificadas con el ADN, el método implica algunas dificultades, como un paso de fragmentación de la cromatina, en la práctica. La sonicación ha sido ampliamente utilizada para el cizallamiento de cromatina; sin embargo, es engorroso identificar condiciones reproducibles. El tratamiento de la nucleasa microcócica (MNase) es un método alternativo para la cizalladura de cromatina. MNase es una endo-exonucleasa que digiere ADN y ARN de doble cadena, de una sola cadena, circular y lineal. Es relativamente fácil determinar las condiciones, incluyendo las cantidades de cromatina y enzima, temperatura y tiempo de incubación, para una fragmentación óptima de la cromatina. Modificamos y simplificamos los protocolos existentes, y establecimos un método sencillo y reproducible. Este documento proporciona el protocolo para un ensayo ChIP utilizando MNase en células de mamíferos.

Protocol

1. Preparación de reactivos Haga una solución de paraformaldehida (PFA) del 18,5%. Añadir 0,925 g de PFA, 4,8 ml de agua (utilizar agua ultrapurificada en todo el protocolo) y 35 ml de KOH de 1 M en un tubo de plástico cónico de 50 ml. Cierre bien la tapa y caliente el tubo en un vaso de vidrio de 400-600 ml que contenga aproximadamente 200 ml de agua utilizando un microondas. Retire el tubo antes de que el agua comience a hervir y vórtice el tubo para disolver la PFA. Deje que el PFA se enfríe a tempera…

Representative Results

La digestión de la cromatina es uno de los pasos importantes para un ensayo DeC. Usamos MNase para digerir la cromatina para obtener una mezcla de oligómeros nucleosos. En el paso de digestión MNase, MNase puede pasar a través de la membrana nuclear y digerir la cromatina. Sin embargo, la cromatina digerida no puede pasar a través de la membrana y permanece en los núcleos. Para liberar la cromatina digerida de los núcleos, se necesita una breve sonicación. La Figura 1A muestra microf…

Discussion

Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para obtener cromatina fragmentada, es lento y engorroso identificar condiciones reproducibles. En este protocolo, utilizamos la digestión MNase porque la digestión enzimática debería ser más fácil de identificar condiciones reproducibles. Un breve paso de sonicación después de la digestión de la MNase (ver paso 2.2) fue necesario para romper la membrana celular y liberar la cromatina digerida. Por lo tanto, el poder de sonicación en nuestro protocolo debe ser lo má…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación es apoyada por las regalías de Genentech a la Ciudad de la Esperanza. Este trabajo no es apoyado total o parcialmente por los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2X iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6X) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

References

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Cite This Article
Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

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