כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים
Summary
כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.
Abstract
כדי לבטא פנוטיפים סלולריים באורגניזמים, תאים חיים לבצע ביטוי גנים בהתאם, ו הטרנססקריפט תוכניות לשחק תפקיד מרכזי בביטוי גנים. מכונות הסלולר והשינויים הכרומטין שלהם מתאמים לווסת את התמלול. כדי לנתח את הרגולציה ברמה המולקולרית, מספר שיטות נסיוניות כגון משמרת ניידות אלקטרופיניטית, כתב ארעי וכרומטין immunoprecipitation (שבב) בחני זמינים. אנו מתארים שינויים שבב שונה בפירוט במאמר זה בשל יתרונותיה של הצגת ישירות שינויים היסטון ואת האינטראקציות בין חלבונים DNA בתאים. אחד משלבי המפתח בתוך שיטת שבבים מוצלחת הוא הטיית כרומטין. למרות שsonication משמשת בדרך כלל לחיתוך כרומטין, קשה לזהות תנאים הנמצאים בשימוש. במקום הטיית כרומטין על ידי sonication, אנו מנוצל העיכול אנזימטיות עם מmicrococcal נוקלאז (mnase) כדי לקבל תוצאות לאחר מכן. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול שיטת שימוש ישירה של שבב באמצעות MNase.
Introduction
ביטוי הגנים בתאי היונקים הוא הדוק ומוסדר באופן דינמי, ותמלול הוא אחד משלבי המפתח. תמלול הגנים מוסדר בעיקר על ידי שעתוק והאבנים. גורם שעתוק הוא חלבון הנקשר רצפי DNA ספציפיים ושולט תמלול הגנים. גורמים אלה או לקדם או לעכב את הגיוס של RNA פולימראז II (PolII), אשר יוזם סינתזה mRNA מ-DNA גנומית כתבנית1. היסטון שינויים כגון מרחרחון ומתילציה של שאריות זנב האבן באופן חיובי ולרעה להשפיע על תמלול הגנים על ידי שינוי מבנה כרומטין2. מאחר ששינויים בביטוי הגנים משפיעים על ההקשר הסלולארי, חיוני לבחון את המנגנונים המולקולריים שעליהם מוסדר התמלול.
עד היום, מספר שיטות לחקירת התקנה של שעתוק גנים זמינים. שינוי ביכולת ניידות אלקטרופיניטית (EMSA), המכונה גם שיטת שינוי ג’ל, משמשת לניתוח אינטרקציה של חלבון DNA3. תמצית גרעינית מתאי העניין היא מודמת עם איזוטופ רדיואקטיבי (לדוגמה, 32P)-התווית בדיקת DNA ו אלקטרופורציםעל ג’ל פוליאקרילמיד. הautoradiogram שלו מראה כי מורכבות ה-DNA-חלבון נודד לאט יותר מאשר הגשוש ב ג’ל. בנוכחות נוגדן נגד החלבון, מתחם ה-DNA-חלבון-נוגדן נודד בג לאט יותר מאשר מתחם ה-DNA-חלבון. הלהקה הזאת שהוזזה מגלה את הכריכה המסוימת בין הדנ א לחלבון. עם זאת, EMSA קובע רק אינטראקציה ספציפית ל-DNA-חלבון במערכת ללא תא, ולכן היא עדיין אינה ידועה אם האינטראקציה שולטת בתמלול של תאים חיים. שיטת העיתונאי החולף, המכונה בדרך כלל בשיטת לוציפראז, פותחה כדי לטפל בתקנות ביטוי גנים בתאים. בדרך כלל, אזור גנומית במעלה הזרם של גן של עניין מוכנס לתוך הפלבאמצע הכתב, מנוכר באופן מבוקר לתוך תאים, ופעילות העיתונאי נמדד. מגוון של מוטציות מחיקה מאפשר זיהוי של אזורים האחראים לתקנות גנים. אף-על-פי שיטת העיתונאי הוא כלי שימושי לזיהוי גורמי התמלול ומחייב רצפי DNA שליטה שעתוק, שיטה זו יש חיסרון משמעותי כי הכתב פלבאמצע הוא ללא מבנה כרומטין ואינו משקף “אמיתי” מכונות שעתוק. בנוסף, לא ניתן לקבוע שינויים בשינויים באבן במערכת.
הפיתוח של שיטת כרומטין immunoprecipitation (שבב) היה מבוסס על הדוחות של ג’קסון וכלקלי כי “תא שלם” קיבעון עם פורמלדהיד שימר מבנה כרומתין4,5. מאז, טכניקות רבות הקשורות פותחו והשתפרו6. ב השבב assays, תאים קבועים עם פורמלדהיד כדי להצליב קישור DNA ו חלבונים. , הכרוטין מפוצלת. ואז מimmunoprecipitated עם נוגדנים מעניינים , הקומפלקס החיסוני נשטף. והדנ א מטוהר ה-PCR הגברה עם מטרה ממוקדת באזור מסוים של הגנום חושף את התפוסה של חלבונים של עניין בגנום.
למרות שבב הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות את האינטראקציות של חלבונים כגון שעתוק גורמים ושונה יסטוניים עם ה-DNA, השיטה כרוכה בקשיים מסוימים, כגון שלב הפיצול כרומטין, בפועל. Sonication שימש רבות לחיתוך כרומטין; עם זאת, מסורבל לזהות תנאים שאינם מזהים. טיפול מmicrococcal (MNase) הוא שיטה חלופית להטיה של כרומטין. MNase הוא אנדו-אקסאוכירות שעיכול כפול תקוע, יחיד תקועים, מעגלי ו-DNA ליניארי ו-RNA. קל יחסית לקבוע את התנאים, כולל הכמויות של כרומטין ואנזימים, טמפרטורה וזמן דגירה, עבור פיצול כרומטין אופטימלי. הצלחנו לשנות ולפשט את הפרוטוקולים הקיימים, והקמנו שיטה ישירה וברורה. נייר זה מספק את הפרוטוקול עבור שיטת השבב באמצעות MNase בתאי היונקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שsonication משמש בדרך כלל להשגת כרומטין מפוצלים, היא גוזלת זמן ומסורבלת כדי לזהות תנאים שאינם משתמשים. בפרוטוקול זה, השתמשנו בעיכול MNase מכיוון שעיכול האנזים צריך להיות קל יותר לזהות תנאים הניתנים לשימוש. צעד קצר sonication לאחר העיכול MNase (ראה שלב 2.2) היה הכרחי כדי לשבור את קרום התא ולשחרר את כרו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי Genentech תמלוגים על עיר התקווה. עבודה זו אינה נתמכת בכללותה או בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
