Хроматин ИммунопрецитатА Ассасси использованием микрококковой nucleases в клетках млекопитающих
Summary
Хроматин иммунопрецитисцией (ЧИП) является мощным инструментом для понимания молекулярных механизмов регуляции генов. Тем не менее, метод включает в себя трудности в получении воспроизводимого фрагментации хроматина с помощью механической стрижки. Здесь мы предоставляем улучшенный протокол для проведения анализа CHIP с использованием ферментативного пищеварения.
Abstract
Чтобы выразить клеточные фенотипы в организмах, живые клетки выполняют экспрессию генов соответственно, а транскрипционные программы играют центральную роль в экспрессии генов. Клетовая транскрипционная техника и его белки модификации хроматина координируют регулирование транскрипции. Для анализа транскрипционной регуляции на молекулярном уровне доступны несколько экспериментальных методов, таких как электрофоретический сдвиг подвижности, переходный репортер и хроматин иммунопреципция (ЧиП). Мы подробно описываем в этой статье измененный анализ CHIP из-за его преимуществ в непосредственном показе модификаций гистона и взаимодействия между белками и ДНК в клетках. Одним из ключевых шагов в успешном анализе CHIP является стрижка хроматина. Хотя sonication обыкновенно использован для стрижки chromatin, трудно определить воспроизводимые условия. Вместо того, чтобы стрижка хроматина путем звуковой, мы использовали ферментативное пищеварение с микрококковой нуклеазы (MNase), чтобы получить более воспроизводимые результаты. В этой статье мы предоставляем простой протокол анализов CHIP с использованием MNase.
Introduction
Выражение генов в клетках млекопитающих жестко и динамично регулируется, и транскрипция является одним из ключевых шагов. Транскрипция гена в основном регулируется транскрипционными факторами и гистонами. Фактор транскрипции является белком, который связывается с конкретными последовательностями ДНК и контролирует транскрипцию генов. Эти факторы либо способствуют или препятствуют набору РНК-полимеразы II (PolII), котораяинициирует синтез мРНК из геномной ДНК в качестве шаблона 1. Гистон модификации, такие как ацетилирование и метилирование остатков хвоста гистона положительно и негативно влияют на транскрипцию генов, изменяя структуру хроматина2. Поскольку изменения в экспрессии генов влияют на клеточный контекст, важно изучить молекулярные механизмы, с помощью которых регулируется транскрипция.
На сегодняшний день имеется несколько методов исследования регуляции транскрипции генов. Электрофоретическая мобильность сдвиг анализа (EMSA), также называемый гель сдвиг анализ, используется для анализа белка-ДНК взаимодействия3. Ядерный экстракт из интересных клеток инкубируется радиоактивным изотопом (например, 32P) с маркировкой ДНК-зондом и электрофоресом на геле полиакриламидов. Его авторадиограмма показывает, что ДНК-белковый комплекс мигрирует медленнее, чем зонд в геле. При наличии антитела к белку комплекс ДНК-белка-антитела мигрирует в гель медленнее, чем в ДНК-белковый комплекс. Эта сверхсмещенная полоса выявляет специфическую связывание между ДНК и белком. Тем не менее, EMSA определяет только специфическое взаимодействие ДНК-белка в системе, свободной от клеток, и поэтому остается неизвестным, контролирует ли взаимодействие транскрипцию в живых клетках. Переходный репортер ассси, обычно называемый luciferase репортер асссее, был разработан для решения регулировки экспрессии генов в клетках. Как правило, в репортерскую плазмиду вставляется ген ген, который временно трансгруппируется в клетки, и измеряется активность репортера. Разнообразие мутантов удаления позволяет идентифицировать регионы, которые отвечают за регуляцию генов. Несмотря на то, что анализ репортера является полезным инструментом для выявления транскрипционных факторов и связывания последовательностей ДНК, контролирующих транскрипцию, этот метод имеет большой недостаток в том, что репортер плазмида свободна от структуры хроматина и не отражает “реальные” транскрипционно-транскрипционном механизме. Кроме того, изменения в модификациях гистона не могут быть определены системой.
Развитие метода иммунопреципиции хроматина (ChIP) было основано на сообщениях Джексона и Чалкли о том, что «целая клетка» фиксации с формальдегидом сохранившейся хроматина структуры4,5. С тех пор, многие соответствующие методы были разработаны и улучшены6. В анализах CHIP клетки фиксируются формальдегидом, чтобы связать ДНК и белки. Хроматин фрагментируется, а затем иммунопроцелитируется антителами, представляющими интерес. Иммунный комплекс промывают, а ДНК очищается. Усиление ПЦР с помощью грунтовок, ориентированных на определенный регион генома, свидетельствует о заполняемости белков, представляющих интерес для генома.
Хотя CHIP является мощным инструментом для выявления взаимодействий белков, таких как транскрипционные факторы и модифицированные гистоны с ДНК, метод включает в себя некоторые трудности, такие как шаг фрагментации хроматина, на практике. Соникация широко используется для стрижки хроматина; однако определить воспроизводимые условия обременительно. Лечение микрококковой нуклеазой (MNase) является альтернативным методом стрижки хроматина. MNase является эндо-экзонуклеизом, который переваривает двуцепочечную, одноцепочечную, круговую и линейную ДНК и РНК. Относительно легко определить условия, в том числе количество хроматина и фермента, температуру и время инкубации, для оптимальной фрагментации хроматина. Мы изменили и упростили существующие протоколы, и мы создали простой и воспроизводимый метод. В этом документе содержится протокол для tIP-ассссссса с использованием MNase в клетках млекопитающих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя sonication обыкновенно использован для того чтобы получить фрагментированный хроматин, оно требующий много времени и громоздкое для того чтобы определить воспроизводимые условия. В этом протоколе мы использовали пищеварение MNase, потому что пищеварение ферментов должно быть легче опр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается Genentech роялти в город надежды. Эта работа не поддерживается в целом или частично Национальными институтами здравоохранения.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
