Microfocus X-ray CT (microCT) Imagerie d'Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), et Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Summary
Ici, les protocoles pour effectuer l’imagerie par tomodensitométrie par rayons X (microCT) de trois animaux invertébrés marins sont expliqués en détail. Cette étude décrit des étapes telles que la fixation de l’échantillon, la coloration, le montage, la numérisation, la reconstruction d’images et l’analyse des données. Des suggestions sur la façon dont le protocole peut être ajusté pour différents échantillons sont également fournies.
Abstract
Traditionnellement, les biologistes ont dû s’appuyer sur des méthodes destructrices telles que la section pour étudier les structures internes des organismes opaques. L’imagerie par tomodensitométrie par rayons X (microCT) microfocus non destructive est devenue un protocole puissant et émergent en biologie, en raison des progrès technologiques dans les méthodes de coloration des échantillons et les innovations dans le matériel microCT, les ordinateurs de traitement et les données logiciel d’analyse. Cependant, ce protocole n’est pas couramment utilisé, comme c’est le cas dans les domaines médical et industriel. L’une des raisons de cette utilisation limitée est l’absence d’un manuel simple et compréhensible qui couvre toutes les étapes nécessaires : prélèvement d’échantillons, fixation, coloration, montage, numérisation et analyse des données. Une autre raison est la grande diversité des métazoaires, en particulier les invertébrés marins. En raison de la diversité des tailles, des morphologies et des physiologies des invertébrés marins, il est crucial d’ajuster les conditions expérimentales et les configurations matérielles à chaque étape, selon l’échantillon. Ici, les méthodes d’imagerie microCT sont expliquées en détail à l’aide de trois invertébrés marins phylogénétiquement divers : Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) et Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Des suggestions sur l’exécution de l’imagerie microCT sur divers animaux sont également fournies.
Introduction
Les chercheurs en biologie ont généralement dû faire des sections minces et effectuer des observations par microscopie légère ou électronique afin d’étudier les structures internes des organismes opaques. Cependant, ces méthodes sont destructrices et problématiques lorsqu’elles sont appliquées à des spécimens rares ou précieux. En outre, plusieurs étapes de la méthode, telles que l’encastrement et la sectionnement, prennent du temps, et il peut prendre plusieurs jours pour observer un échantillon, selon le protocole. En outre, lors de la manipulation de nombreuses sections, il ya toujours une possibilité d’endommager ou de perdre certaines sections. Des techniques de défrichement sont disponibles pour certains spécimens1,2,3,4,5 mais ne sont pas encore applicables pour de nombreuses espèces animales.
Pour surmonter ces problèmes, certains biologistes ont commencé à utiliser microfocus radiographie par tomodensitométrie (microCT) imagerie6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Dans la tocrose à rayons X, le spécimen est irradié avec des rayons X sous différents angles qui sont générés à partir d’une source de rayons X se déplaçant autour de l’échantillon, et les rayons X transmis sont surveillés par un détecteur qui se déplace également autour de l’échantillon. Les données de transmission aux rayons X obtenues sont analysées pour reconstituer des images transversales du spécimen. Cette méthode permet l’observation des structures internes sans destruction de l’échantillon. En raison de sa sécurité et de sa facilité, il est couramment utilisé dans les applications médicales et dentaires, et les systèmes de Tomode peuvent être trouvés dans les hôpitaux et les centres dentaires dans le monde entier. De plus, la toctologie à rayons X industrielle est fréquemment utilisée pour observer des échantillons non médicaux aux fins d’inspection et de métrologie dans le domaine industriel. Contrairement à la ToMode médicale, dans laquelle la source de rayons X et les détecteurs sont mobiles, les deux parties sont fixées en CT industriel, l’échantillon tournant pendant la numérisation. Le CT industriel produit généralement des images à plus haute résolution que la toctorde médicale et est appelé microCT (résolution micrométrique) ou nanoCT (résolution nanométrique). Récemment, la recherche utilisant le microCT a rapidement augmenté dans divers domaines de la biologie14,15,16,17,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 Annonces , 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34.
Les études biologiques utilisant CT ont au commencement visé des structures internes qui se composent principalement des tissus durs, tels que l’os. Les progrès dans les techniques de coloration utilisant divers agents chimiques ont permis la visualisation des tissus mous dans divers organismes6,7,8,9,14,15 , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 Annonces , 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34. Parmi ces réactifs, les agents de contraste à base d’iode sont relativement sûrs, peu coûteux et peuvent être utilisés pour la visualisation des tissus mous dans divers organismes7,14. En ce qui concerne les invertébrés marins, le microCT a été largement utilisé sur des animaux tels que les mollusques6,25,32,33, annelides18,19, 20 Ans, états-unis , 28, et les arthoropodes21,23,29,31. Cependant, il ya eu peu de rapports sur d’autres phyla animales, tels que les bryozoaires6, xenacoelomorphs26, et les cnidaires24,30. En général, il y a eu moins d’études utilisant le microCT sur les invertébrés marins que sur celles sur les vertébrés. L’une des principales raisons de cette utilisation limitée des invertébrés marins est la grande diversité observée chez ces animaux. En raison de leurs diverses tailles, morphologies et physiologies, chaque espèce réagit différemment aux différentes procédures expérimentales. Par conséquent, il est crucial pendant la préparation de l’échantillon de choisir le réactif de fixation et de coloration le plus approprié, et de fixer les conditions à chaque étape, ajustée pour chaque espèce. De même, il est également nécessaire de définir les configurations de balayage, telles que la méthode de montage, la tension, le courant, le taux de grossissement mécanique, et la puissance de résolution de l’espace, de manière appropriée pour chaque échantillon. Pour surmonter ce problème, un manuel simple et compréhensible qui couvre toutes les étapes nécessaires, explique comment chaque étape peut être ajustée en fonction du spécimen, et montre des exemples détaillés à partir de plusieurs échantillons est essentiel.
Dans la présente étude, nous décrivons le protocole d’imagerie microCT étape par étape, de la fixation de l’échantillon à l’analyse des données, en utilisant trois espèces d’invertébrés marins. Des spécimens de l’anémone de mer Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) ont été recueillis près de la station biologique marine de Misaki, Université de Tokyo. Ils avaient un corps sphérique et mou d’environ 2 cm de diamètre (figure1A-C). Des échantillons de Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) ont également été prélevés près de la station biologique marine de Misaki. Il s’agissait de vers minces d’environ 1,5 cm de longueur, avec des chaetae dures présentes tout le corps (figure1D). Un spécimen de Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) a été prélevé près du Centre de recherche marine de Shimoda, Université de Tsukuba, au cours de la 13e enquête conjointe sur les organismes côtiers DE JAMBIO. Il s’agissait d’un ver à corps mou d’environ 0,8 cm de longueur (figure 1E). Les ajustements effectués pour les conditions et les configurations de chaque échantillon sont expliqués en détail. Notre étude fournit plusieurs suggestions sur la façon d’effectuer l’imagerie microCT sur les invertébrés marins, et nous espérons qu’elle inspirera les biologistes à utiliser ce protocole pour leurs recherches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les fixatifs utilisant la formaline, tels que la solution formaline de 10 % (v/v) dans l’eau de mer utilisée dans cette étude, sont connus pour préserver la morphologie de divers invertébrés marins et sont souvent utilisés pour l’imagerie microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Cependant, des r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Toshihiko Shiroishi pour son aide et pour fournir l’environnement de recherche au cours de cette étude. Nous sommes reconnaissants à Kensuke Yanagi et Takato Izumi pour des conseils sur A. equina, et Masaatsu Tanaka pour des conseils sur le spécimen Harmothoe sp. Nous tenons à remercier le personnel du Shimoda Marine Research Center, de l’Université de Tsukuba et de la station biologique marine de Misaki, à l’Université de Tokyo, pour leur aide dans les collections d’échantillons. Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l’édition en anglais. Ce travail a été soutenu par le JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) à HN, et JAMBIO, Japanese Association for Marine Biology.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
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