Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Pesquisadores biológicos geralmente tiveram que fazer cortes finos e realizar observações por microscopia de luz ou eletrônica, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. No entanto, esses métodos são destrutivos e problemáticos quando aplicados a espécimes raros ou valiosos. Além disso, várias etapas no método, como incorporação e corte, são demoradas e pode demorar vários dias para observar uma amostra, dependendo do protocolo. Além disso, ao manusear inúmeras secções, existe sempre a possibilidade de danificar ou perder algumas secções. As técnicas do tecido-esclarecimento estão disponíveis para alguns espécimes^1,2,3,4,5 mas não são ainda aplicáveis para muitas espécies animais.

Para superar esses problemas, alguns biólogos começaram a usar a tomografia computadorizada de raios X microfoco (microct) Imaging^{6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15}. Na TC de raios-X, o espécime é irradiado com raios-X de vários ângulos que são gerados a partir de uma fonte de raios-X movendo-se em torno da amostra, e os raios-X transmitidos são monitorados por um detector que também se move em torno da amostra. Os dados de transmissão de raios-X obtidos são analisados para reconstruir imagens transversais do espécime. Este método possibilita a observação de estruturas internas sem destruição da amostra. Por causa de sua segurança e facilidade, é comumente usado em aplicações médicas e odontológicas, e os sistemas de TC podem ser encontrados em hospitais e centros odontológicos em todo o mundo. Além disso, o raio X Industrial CT é usado freqüentemente observando amostras não médicas para a inspeção e a metrologia no campo industrial. Em contraste com a TC médica, na qual a fonte de raios X e os detectores são móveis, as duas partes são fixadas em TC Industrial, com a amostra girando durante a digitalização. A TC Industrial geralmente produz imagens de maior resolução do que a TC médica e é referida como microCT (resolução em nível de micrômetro) ou nanoCT (resolução em nível de nanômetro). Recentemente, a pesquisa usando microct aumentou rapidamente em vários campos da biologia^{14,15,16,17,18,19, 20} anos de ^{, 21} anos de ^{, 22} anos de ^{, 23} anos de ^{, 24} de cada ^{, 25} anos de ^{, 26} anos de ^{, 27} anos de ^{, 28} anos de ^{, 29. º , 30} anos de ^{, 31 de dezembro , 32 , 33 , 34}.

Os estudos biológicos que usam o CT inicialmente alvejou estruturas internas que consistem principalmente no tecido duro, tal como o osso. Avanços nas técnicas de coloração utilizando vários agentes químicos permitiram a visualização de tecidos moles em vários organismos^{6,7,8,9,14,15 , 16 anos} de ^{, 17} anos de ^{, 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20} anos de ^{, 21} anos de ^{, 22} anos de ^{, 23} anos de ^{, 24} de cada ^{, 25} anos de ^{, 26} anos de ^{, 27} anos de ^{, 28} anos de ^{, 29. º , 30} anos de ^{, 31 de dezembro , 32 , 33 , 34}. destes reagentes, os agentes de contraste à base de iodo são relativamente seguros, baratos e podem ser utilizados para a visualização de tecidos moles em vários organismos^7,14. No que diz respeito aos invertebrados marinhos, a microtomografia tem sido amplamente utilizada em animais como moluscos^6,25,32,33, anípidos^{18,19, 20} anos de ^{, 28}, e arthorópodes^21,23,29,31. No entanto, houve poucos relatos sobre outros animais phyla, como briozoários⁶, xenacoelomorphs²⁶e cnidários^24,30. Em geral, houve menos estudos usando microCT em invertebrados marinhos do que aqueles em vertebrados. Uma das principais razões para este uso limitado em invertebrados marinhos é a vasta diversidade observada nestes animais. Por causa de seus diversos tamanhos, morfologias e fisiologias, cada espécie reage diferentemente a diferentes procedimentos experimentais. Portanto, é crucial durante a preparação da amostra escolher o reagente de fixação e coloração mais adequado, e definir as condições em cada etapa, ajustadas para cada espécie. Da mesma forma, também é necessário definir as configurações de digitalização, como o método de montagem, tensão, corrente, taxa de ampliação mecânica e o poder de resolução de espaço, apropriadamente para cada amostra. Para superar esse problema, um manual simples e compreensível que abrange todas as etapas necessárias, explica como cada etapa pode ser ajustada dependendo da amostra, e mostra exemplos detalhados de várias amostras é essencial.

No presente estudo, descrevemos o protocolo de imagem microCT passo a passo, desde a fixação da amostra até a análise dos dados, utilizando-se três espécies de invertebrados marinhos. Os espécimes da Anemone de mar Actinia equina da (Anthozoa, Cnidaria) foram recolhidos perto da Estação Biológica Marinha de Misaki, Universidade de Tokyo. Eles tinham um corpo esférico e macio que tinha cerca de 2 cm de diâmetro (Figura 1a-C). As amostras de Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) também foram coletadas perto da Estação Biológica Marinha Misaki. Eram vermes finos que tinham cerca de 1,5 cm de comprimento, com cerdas resistentes presentes ao longo de todo o corpo (Figura 1D). Um espécime Xenoturbella japonica³⁵ (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) foi coletado perto do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, durante a 13ª pesquisa conjunta do organismo costeiro jambio. Era um verme macio-encorpado que tinha cerca de 0,8 cm de comprimento (Figura 1e). Os ajustes feitos para as condições e as configurações de cada amostra são explicados em detalhe. Nosso estudo fornece várias sugestões sobre como executar a imagem microCT em invertebrados marinhos, e esperamos que ele inspire os biólogos a utilizar este protocolo para sua pesquisa.