Микрофокус рентгеновских КТ (микроКТ) Изображение Эктинии эквины (Cnidaria), Harmothoe sp. (Аннелида), и Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Биологические исследователи, как правило, были вынуждены делать тонкие секции и выполнять наблюдения с помощью световой или электронной микроскопии для того, чтобы исследовать внутренние структуры непрозрачных организмов. Однако эти методы являются разрушительными и проблематичными при применении к редким или ценным особям. Кроме того, несколько этапов в методе, таких как встраивание и секция, отнимают много времени, и это может занять несколько дней, чтобы наблюдать образец, в зависимости от протокола. Кроме того, при обработке многочисленных секций всегда есть возможность повреждения или потери некоторых секций. Техника очистки тканей доступнадля некоторых образцов 1,^2,3,4,5, но еще не применимы для многих видов животных.

Чтобы преодолеть эти проблемы, некоторые биологи начали использовать микрофокус рентгеновскойкомпьютерной томографии (микроКТ) изображений 6,^{7,8,9,10,11, 12,13,14,15}. В рентгеновской КТ, образец облучается рентгеновскими лучами с различных углов, которые генерируются из рентгеновского источника, движущегося вокруг образца, и передаваемые рентгеновские лучи контролируются детектором, который также движется вокруг образца. Полученные данные о передаче рентгеновских лучей анализируются для восстановления поперечных изображений образца. Этот метод позволяет наблюдать внутренние структуры без разрушения образца. Из-за своей безопасности и легкости, он широко используется в медицинских и стоматологических приложений, и КТ системы могут быть найдены в больницах и стоматологических центрах по всему миру. Кроме того, промышленный рентгеновский КТ часто используется для наблюдения за немедицинскими образцами для осмотра и метрологии в промышленной сфере. В отличие от медицинской КТ, при которой рентгеновский источник и детекторы подвижны, две части фиксируются в промышленной КТ, при этом образец вращается во время сканирования. Промышленный КТ обычно производит изображения с более высоким разрешением, чем медицинский КТ, и называется микроКТ (разрешение уровня микрометра) или nanoCT (разрешение уровня нанометра). В последнее время исследования с использованием микроCT быстро увеличилось в различных областях биологии^{14,15,16,17,18,19, 20 , 21 год , 22} Г. ^{, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 год , 31} год ^{, 32 год , 33 , 34}.

Биологические исследования с использованием КТ первоначально целевых внутренних структур, которые в основном состоят из твердых тканей, таких как кости. Достижения в области методов окрашивания с использованием различных химических агентов позволили визуализировать мягкие ткани в различных организмах^6,7,^{8,9,14,15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22} Г. ^{, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 год , 31} год ^{, 32 год , 33 , 34}. Из этих реагентов контрастные агенты на основе йода относительно безопасны, недороги и могут быть использованы для визуализации мягких тканей в различных организмах^7,14. Что касается морских беспозвоночных, микрокт широко используется на таких животных, как моллюски^6,25,32,33, annelids^{18,19, 20 , 28}, и тортоподы^21,23,29,31. Тем не менее, было несколько сообщений о других животных phyla, таких как bryozoans⁶, xenacoelomorphs²⁶, и книдарий^24,30. В целом, было меньше исследований с использованием микроКТ на морских беспозвоночных, чем на позвоночных. Одной из основных причин такого ограниченного использования морских беспозвоночных является огромное разнообразие, наблюдаемое у этих животных. Из-за своих разнообразных размеров, морфологии и физиологии, каждый вид по-разному реагирует на различные экспериментальные процедуры. Поэтому при подготовке к образу отбора крайне важно выбрать наиболее подходящую фиксацию и окрашивающий реагент, а также установить условия на каждом шагу, скорректированные для каждого вида. Аналогичным образом, необходимо также установить конфигурации сканирования, такие как метод монтажа, напряжение, текущая, механическая скорость увеличения и мощность разрешения пространства, соответствующая для каждого образца. Для решения этой проблемы необходимо простое и понятное руководство, которое охватывает все необходимые шаги, объясняет, как каждый шаг может быть скорректирован в зависимости от образца, и показывает подробные примеры из нескольких образцов.

В настоящем исследовании мы описываем протокол микрокт-изображения шаг за шагом, от фиксации образцов до анализа данных с использованием трех видов морских беспозвоночных. Образцы морского анемона Actinia equina (Антхозоа, Книдария) были собраны вблизи морской биологической станции Мисаки, Токийский университет. У них было сферическое, мягкое тело диаметром около 2 см(рисунок 1A-C). Вблизи морской биологической станции Мисаки были также собраны образцы Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida). Они были стройные черви, которые были около 1,5 см в длину, с жесткими chaetae настоящее время вдоль всего тела (Рисунок 1D). Образец Xenoturbella japonica³⁵ (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) был собран вблизи морского исследовательского центра Симода, Университет Цукуба, во время 13-го совместного обследования прибрежных организмов JAMBIO. Это был мягкотелый червь длиной около 0,8 см(рисунок 1E). Подробно разъясняются корректировки условий и конфигураций каждого образца. Наше исследование содержит несколько предложений о том, как выполнять микрокт изображения морских беспозвоночных, и мы надеемся, что это вдохновит биологов использовать этот протокол для своих исследований.