ميكروفوكس الأشعة السينية CT (microCT) التصوير من أكتينيا إكوينا (Cnidaria)، Harmothoe sp. (Annelida)، وXenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Summary
هنا، يتم شرح بروتوكولات إجراء التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) لثلاثة من الحيوانات اللافقارية البحرية بالتفصيل. تصف هذه الدراسة خطوات مثل تثبيت العينة، وتلطيخ العينة، والتركيب، والمسح الضوئي، وإعادة بناء الصورة، وتحليل البيانات. كما تقدم اقتراحات بشأن كيفية تعديل البروتوكول لعينات مختلفة.
Abstract
وتقليديا، كان على علماء الأحياء أن يعتمدوا على أساليب تدميرية مثل التشعب من أجل التحقيق في الهياكل الداخلية للكائنات الحية غير الشفافة. أصبح التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) غير المدمرة بروتوكولًا قويًا وناشئًا في علم الأحياء، وذلك بسبب التقدم التكنولوجي في أساليب تلطيخ العينات والابتكارات في أجهزة microCT وأجهزة المعالجة والبيانات تحليل البرمجيات. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول غير شائع الاستخدام، كما هو الحال في المجالين الطبي والصناعي. أحد أسباب هذا الاستخدام المحدود هو عدم وجود دليل بسيط ومفهوم يغطي جميع الخطوات الضرورية: جمع العينات، والتثبيت، وتلطيخ، وتركيب، والمسح الضوئي، وتحليل البيانات. وثمة سبب آخر هو التنوع الواسع للميتازوان، ولا سيما اللافقاريات البحرية. وبسبب الأحجام المتنوعة لللافقاريات البحرية، والمورفولوجيا، والفيزيولوجيا، من الأهمية بمكان ضبط الظروف التجريبية وتكوينات الأجهزة في كل خطوة، حسب العينة. هنا، يتم شرح أساليب التصوير المجهري بالتفصيل باستخدام ثلاثة لافقاريات بحرية متنوعة وراثيا: أكتينيا إكوينا (أنثوزوا، كانيداريا)، هارموتهو سب(بوليشيتا، أنيليدا)، وXenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). كما تقدم اقتراحات بشأن إجراء التصوير المجهري على مختلف الحيوانات.
Introduction
وكان على الباحثين البيولوجيين عموما أن يقوموا بأقسام رفيعة وأن يقوموا بالمراقبة عن طريق المجهر الضوئي أو الإلكتروني من أجل التحقيق في الهياكل الداخلية للكائنات الحية غير الشفافة. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب مدمرة وإشكالية عند تطبيقها على عينات نادرة أو قيمة. وعلاوة على ذلك، عدة خطوات في الأسلوب، مثل التضمين والمقطع، تستغرق وقتاً طويلاً، ويمكن أن يستغرق عدة أيام لمراقبة عينة، اعتماداً على البروتوكول. وعلاوة على ذلك، عند التعامل مع العديد من الأقسام، هناك دائما إمكانية إلحاق الضرر أو فقدان بعض الأقسام. تقنيات إزالة الأنسجة متاحةلبعض العينات 1،2،3،4،5 ولكن لا تنطبق حتى الآن على العديد من الأنواع الحيوانية.
للتغلب على هذه المشاكل، بدأ بعض علماء الأحياء باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية(microCT)6و7و8 و9 و10و11، 12،13،14،15. في الأشعة السينية المقطعية، يتم تشعيع العينة بأشعة سينية من زوايا مختلفة يتم إنشاؤها من مصدر الأشعة السينية التي تتحرك حول العينة، ويتم رصد الأشعة السينية المرسلة بواسطة كاشف يتحرك أيضا حول العينة. يتم تحليل بيانات الإرسال بالأشعة السينية التي تم الحصول عليها لإعادة بناء الصور المقطعية للعينة. تمكن هذه الطريقة من مراقبة الهياكل الداخلية دون تدمير العينة. بسبب سلامتها وسهولة، ويستخدم عادة في التطبيقات الطبية وطب الأسنان، ويمكن العثور على أنظمة التصوير المقطعي المحوسب في المستشفيات ومراكز طب الأسنان في جميع أنحاء العالم. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما تستخدم الأشعة السينية الصناعية للأشعة المقطعية لمراقبة العينات غير الطبية للتفتيش والقياس في المجال الصناعي. وعلى النقيض من التصوير المقطعي المحوسب الطبي، الذي يكون فيه مصدر الأشعة السينية وأجهزة الكشف متنقلة، يتم إصلاح الجزأين في التصوير المقطعي المحوسب الصناعي، مع تدوير العينة أثناء المسح الضوئي. تنتج CT الصناعية بشكل عام صورًا ذات دقة أعلى من التصوير المقطعي المحوسب الطبي ويشار إليها باسم microCT (دقة على مستوى الميكرومتر) أو nanoCT (دقة على مستوى النانومتر). في الآونة الأخيرة، وقد زادت البحوث باستخدام microCT بسرعة في مختلف مجالات البيولوجيا14،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
استهدفت الدراسات البيولوجية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب في البداية الهياكل الداخلية التي تتكون أساسا من الأنسجة الصلبة، مثل العظام. التقدم في تقنيات تلطيخ باستخدام مختلف العوامل الكيميائية تمكينالتصور من الأنسجة الرخوة في مختلف الكائنات الحية 6،7،8،9،14،15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34– ومن بين هذه الكواشف، تكون عوامل التباين القائمة على اليود مأمونة نسبيا وغير مكلفة، ويمكن استخدامها في تصور الأنسجة الرخوة في مختلف الكائنات الحية7و14. وفيما يتعلق باللافقاريات البحرية، تم استخدام microCTعلى نطاق واسع على الحيوانات مثل الرخويات 6،25،32،33،الأنليدات18،19، 20 , 28، وarthoropods21،23،29،31. ومع ذلك، كانت هناك تقارير قليلة عن فيلا الحيوانات الأخرى، مثل bryozoans6، xenacoelomorphs26، وcnidarians24،30. وبوجه عام، كانت هناك دراسات أقل استخداماً للميكروكت على اللافقاريات البحرية من الدراسات المتعلقة بالفقاريات. وأحد الأسباب الرئيسية لهذا الاستخدام المحدود لللافقاريات البحرية هو التنوع الواسع الذي لوحظ في هذه الحيوانات. بسبب أحجامها المتنوعة، والمورفولوجيا، والفيزيولوجيا، كل نوع يتفاعل بشكل مختلف مع الإجراءات التجريبية المختلفة. ولذلك، فمن الأهمية بمكان أثناء إعداد العينة لاختيار التثبيت الأنسب وتلطيخ الكاشف، ووضع الظروف في كل خطوة، وتعديلها لكل نوع. وبالمثل، فمن الضروري أيضا لتعيين تكوينات المسح الضوئي، مثل طريقة التركيب، والجهد، والحالية، ومعدل المكبرة الميكانيكية، ومساحة القرار السلطة، بشكل مناسب لكل عينة. للتغلب على هذه المشكلة، دليل بسيط ومفهوم يغطي جميع الخطوات الضرورية، ويوضح كيف يمكن تعديل كل خطوة اعتمادا على العينة، ويظهر أمثلة مفصلة من عينات متعددة أمر ضروري.
وفي هذه الدراسة، نوصف بروتوكول التصوير المجهري خطوة بخطوة، من تثبيت العينات إلى تحليل البيانات، باستخدام ثلاثة أنواع من اللافقاريات البحرية. وقد جُمعت عينات من النعمان البحرية أكتينيا إكوينا (أنثوزوا، كانداريا) بالقرب من محطة ميساكي البيولوجية البحرية، جامعة طوكيو. كان لديهم كروية، والجسم لينة التي كانت حوالي 2 سم في القطر (الشكل1A-C). كما جُمعت عينات من مادة هارموتهو (بوليشايتا، أنيليدا) بالقرب من محطة ميساكي البيولوجية البحرية. كانت الديدان النحيلة التي كانت حوالي 1.5 سم في الطول، مع chaetae صعبة موجودة على طول الجسم كله (الشكل1D). تم جمع عينة Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) بالقرب من مركز بحوث شيمودا البحرية، جامعة تسوكوبا، خلال المسح المشترك الثالث عشر للكائن الحي الساحلي جامبيو. كانت دودة لينة الجسم الذي كان حوالي 0.8 سم في الطول (الشكل1E). يتم شرح التعديلات التي أجريت لشروط وتكوينات كل عينة بالتفصيل. تقدم دراستنا العديد من الاقتراحات حول كيفية إجراء التصوير المجهري على اللافقاريات البحرية، ونأمل أن يلهم علماء الأحياء لاستخدام هذا البروتوكول لأبحاثهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
المثبتات باستخدام الفورماين، مثل 10٪ (v / v) حل الفورمالين في مياه البحر المستخدمة في هذه الدراسة، ومن المعروف للحفاظ على مورفولوجيا اللافقاريات البحرية المتنوعة وغالبا ما تستخدم لتصوير microCT18،24،25 ،26،28</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر توشيهيكو شيرويشي على مساعدته وعلى توفير البيئة البحثية خلال هذه الدراسة. ونحن ممتنون لكينسوكي ياناغي وتاكاتو إيزومي للحصول على المشورة بشأن A. equina، وMasaatsu تاناكا للحصول على المشورة بشأن عينة Harmothoe sp. نود أن نشكر الموظفين في مركز شيمودا للبحوث البحرية، جامعة تسوكوبا، ومحطة ميساكي البيولوجية البحرية، جامعة طوكيو لمساعدتهم في مجموعات العينات. نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) لتحرير اللغة الإنجليزية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة المساعدة المقدمة للعلماء الشباب (A) (JP26711022) إلى HN، وJAMBIO، الرابطة اليابانية للبيولوجيا البحرية.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
