マイクロフォーカスX線CT(マイクロCT)アクチニアエクイナ(クニダリア)、ハーモトホーsp.(アネリダ)、およびゼノトゥルベラジャポニカ(キセナコエロモルファ)のイメージング
Summary
ここで、3匹の海洋無脊椎動物のマイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(microCT)イメージングを行うためのプロトコルについて詳しく説明する。本研究では、サンプル固定、染色、取り付け、スキャン、画像再構成、データ解析などの手順について説明します。異なるサンプルに対してプロトコルを調整する方法に関する提案も提供されます。
Abstract
伝統的に、生物学者は、不透明な生物の内部構造を調査するために、断面などの破壊的な方法に頼らなければなりませんでした。非破壊マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(microCT)イメージングは、マイクロCTハードウェア、処理コンピュータ、およびデータのサンプル染色方法と技術革新の技術進歩により、生物学における強力で新しいプロトコルとなっています。分析ソフトウェア。しかし、このプロトコルは、医療や産業分野では一般的に使用されていません。この限定的な使用の理由の1つは、サンプル収集、固定、染色、取り付け、スキャン、およびデータ分析など、必要な手順のすべてをカバーするシンプルで分かりやすいマニュアルがないことです。もう一つの理由は、メタゾン、特に海洋無脊椎動物の広大な多様性です。海洋無脊椎動物の多様なサイズ、形態、生理学のために、サンプルに応じて、各ステップで実験条件とハードウェア構成を調整することが重要です。ここでは、マイクロCTイメージング法は、3つの系統的に多様な海洋無脊椎動物を用いて詳細に説明する:アクチニア・エクイナ(アントゾア、クニダリア)、ハーモトホー・sp.(ポリチャエタ、アネリダ)、およびゼノトルベラ・ジャポニカ(ゼヌトゥルベリダ、キセナコエロモルファ)。様々な動物に対してマイクロCTイメージングを行う上での提案も提供される。
Introduction
生物研究者は、一般的に、不透明な生物の内部構造を調べるために、薄い切片を作り、光または電子顕微鏡による観察を行わなければならなかった。しかし、これらの方法は、希少または貴重な標本に適用された場合、破壊的で問題があります。さらに、埋め込みや断面化など、この方法のいくつかの手順には時間がかかり、プロトコルによってはサンプルの観察に数日かかる場合があります。また、多数のセクションを処理する場合、常に一部のセクションを損傷または失う可能性があります。組織除去技術は、一部の標本1、2、3、4、5で利用可能であるが、多くの動物種にはまだ適用できない。
これらの問題を克服するために、一部の生物学者は、マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(microCT)イメージング6、7、8、9、10、11、およびを使用し始めました。 12,13,14,15.X線CTでは、試料の周りを移動するX線源から発生する様々な角度からX線を照射し、送信されたX線は、試料の周りを移動する検出器によって監視されます。得られたX線伝送データを分析し、試料の断面画像を再構築する。この方法は、サンプルを破壊することなく内部構造の観察を可能にします。安全および容易さのために、それは医学および歯科の適用で一般的に使用され、CTシステムは世界中の病院および歯科センターで見つけることができる。また、産業用X線CTは、産業分野における検査や計測用の非医療サンプルの観察に多く使用されています。X線源と検出器が可動式の医療用CTとは対照的に、2つの部品は工業用CTで固定され、スキャン中にサンプルが回転します。産業用CTは一般に医療CTよりも高い解像度の画像を生成し、マイクロCT(マイクロメートルレベルの解像度)またはナノCT(ナノメートルレベルの解像度)と呼ばれています。近年、生物学14、15、16、17、18、19の様々な分野で、マイクロCTを用った研究が急速に増加している。20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28歳,29歳,30歳,31歳,32歳,33歳,34.
CTを用いた生物学的研究は、当初、主に骨などの硬い組織からなる内部構造を標的とした。様々な化学薬品を用いて染色技術を進歩させ、様々な生物6、7、8、9、14、15の軟部組織の可視化を可能にした,16歳,17歳,18歳,19歳,20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28歳,29歳,30歳,31歳,32歳,33歳,34.これらの試薬のうち、ヨウ素系造影剤は比較的安全で安価であり、様々な生物7,14における軟部組織の可視化に使用することができる。海洋無脊椎動物に関しては、軟体動物6、25、32、33、アネリッド18、19などの動物に広く使用されている。20歳,28, およびアルセロポッド21,23,29,31.しかし、ブリオゾン6、キセナコエロモルフ26、クニダリアン24、30などの他の動物フィラに関する報告はほとんどありませんでした。一般に、海洋無脊椎動物に対するmicroCTを用いる研究は脊椎動物に比べて少ない。海洋無脊椎動物に対するこの限定的な使用の主な理由の1つは、これらの動物で観察される広大な多様性です。その多様なサイズ、形態学、生理学のために、各種は異なる実験手順に異なる反応をします。したがって、サンプル調製時には、最も適切な固定および染色試薬を選択し、各工程で条件を設定し、種ごとに調整することが重要です。同様に、取り付け方法、電圧、電流、機械的拡大率、空間分解能などのスキャン構成をサンプルごとに適切に設定することも必要です。この問題を克服するためには、必要なすべてのステップをカバーするシンプルで分かりやすいマニュアルが、各工程を試料に応じて調整する方法を説明し、複数のサンプルからの詳細な例を示す必要があります。
本研究では、3種の海洋無脊椎動物を用いて、サンプル固定からデータ解析まで、microCTイメージングプロトコルを段階的に説明する。東京大学三崎海洋生物局の近くで、アネモネアネアクティニア馬(アントゾア、クニダリア)の標本を採取した。直径約2cmの球状で柔らかい体を持っていた(図1A-C)。三崎海洋生物学ステーション付近では、ハーモトホー(ポリチャエタ、アネリダ)のサンプルも採取した。長さ約1.5cmの細身の虫で、全身に強いシャエタが存在していました(図1D)。第13回JAMBIO沿岸生物共同調査の間、筑波大学下田海洋研究センターの近くで、ゼノトゥルベラ・ジャポニカ35(ゼノトゥルベリダ、ゼナコエロモルファ)の標本を採取した。長さ約0.8cmの柔らかい体の虫でした(図1E)。各サンプルの条件と構成に対して行われた調整について詳しく説明します。本研究は、海洋無脊椎動物に対してマイクロCTイメージングを行う方法に関するいくつかの提案を提供し、生物学者がこのプロトコルを研究に利用するよう促すことを期待しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究で用いられる海水中の10%(v/v)ホルマリン溶液などのホルマリンを用いる固定剤は、多様な海洋無脊椎動物の形態を保存することが知られており、マイクロCTイメージング18、24、25に多く使用されている。 ,26,28,30,33</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
白石敏彦氏のご支援と研究環境の提供に感謝申し上げます。A.エクイナに関するアドバイスをしてくれた柳健介と泉隆人、そしてハーモトホーの標本に関するアドバイスを田中正夏に感謝します。下田海洋研究センター、筑波大学、三崎海洋生物学ステーションのスタッフの皆様に、サンプルコレクションのご協力を賜りますようお申し上げます。英語編集の編集(www.editage.jp)に感謝します。この研究は、JSPS若手科学者支援(A)(JP26711022)と日本海洋生物学会JAMBIOの支援を受けました。
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
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