MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Biologische onderzoekers hebben over het algemeen dunne secties moeten maken en waarnemingen moeten verrichten door licht of elektronenmicroscopie om de inwendige structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Deze methoden zijn echter destructief en problematisch wanneer ze worden toegepast op zeldzame of waardevolle specimens. Bovendien zijn verschillende stappen in de methode, zoals insluiten en snijden, tijdrovend en kan het enkele dagen duren voordat een voorbeeld wordt nageleefd, afhankelijk van het protocol. Bovendien, bij het hanteren van tal van secties, is er altijd een mogelijkheid van beschadiging of verlies van sommige secties. Weefsel clearing technieken zijn beschikbaar voor sommige specimens^1,2,3,4,5 maar zijn nog niet van toepassing op veel diersoorten.

Om deze problemen te overwinnen, zijn sommige biologen begonnen met het gebruik van micro focus röntgenfoto computertomografie (microct) beeldvorming^{6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15}. In X-Ray CT wordt het preparaat bestraald met röntgenstralen vanuit verschillende hoeken die worden gegenereerd uit een röntgenbron die rond het monster beweegt, en worden de verzonden röntgenstralen bewaakt door een detector die ook rond het monster beweegt. De verkregen X-Ray transmissiegegevens worden geanalyseerd om transversale beelden van het preparaat te reconstrueren. Deze methode maakt de observatie van interne structuren mogelijk zonder vernietiging van het monster. Vanwege de veiligheid en het gemak, het wordt vaak gebruikt in medische en tandheelkundige toepassingen, en CT-systemen kunnen worden gevonden in ziekenhuizen en tandheelkundige centra wereldwijd. Bovendien wordt industriële X-Ray CT vaak gebruikt voor het observeren van niet-medische monsters voor inspectie en metrologie in het industriële gebied. In tegenstelling tot de medische CT, waarin de röntgenbron en de detectoren mobiel zijn, zijn de twee onderdelen bevestigd in industriële CT, waarbij het monster wordt gedraaid tijdens het scannen. Industriële CT produceert over het algemeen hogere resolutie beelden dan medische CT en wordt aangeduid als microCT (micrometer-niveau resolutie) of nanoCT (nanometer-niveau resolutie). Onlangs is onderzoek met behulp van microct snel toegenomen in verschillende gebieden van de biologie^{14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34}.

Biologische studies met behulp van CT aanvankelijk gerichte interne structuren die voornamelijk bestaan uit harde weefsel, zoals bot. Vooruitgang in kleurings technieken met behulp van verschillende chemische agentia stelde de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen^{6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34}. van deze reagentia zijn op jodium gebaseerde contrastmiddelen relatief veilig, goedkoop en kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen^7,14. Wat mariene ongewervelde dieren betreft, is microct op grote schaal gebruikt voor dergelijke diersoorten, zoals weekdieren^6,25,32,33, tot^{18,19, 20 , 28}, en arthoropods^21,23,29,31. Er zijn echter weinig rapporten over andere dier fyla, zoals bryozoërs⁶, xenacoelomorphs²⁶en cnidariërs^24,30. Over het algemeen zijn er minder studies met behulp van microCT op mariene ongewervelde dieren dan die op gewervelde dieren. Een belangrijke reden voor dit beperkte gebruik op mariene ongewervelde dieren is de enorme diversiteit die in deze diersoorten wordt waargenomen. Door hun uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën reageert elke soort verschillend op verschillende experimentele procedures. Daarom is het van cruciaal belang tijdens de monstervoorbereiding om de meest geschikte fixatie-en kleurings reagens te kiezen en voorwaarden vast te stellen bij elke stap, aangepast voor elke soort. Evenzo is het ook noodzakelijk om de scan configuraties in te stellen, zoals de montagemethode, spanning, stroom, mechanische vergrotings snelheid en het ruimte resolutievermogen, op passende wijze voor elk monster. Om dit probleem te overwinnen, een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle van de nodige stappen dekt, legt uit hoe elke stap kan worden aangepast afhankelijk van het specimen, en toont gedetailleerde voorbeelden uit meerdere monsters is essentieel.

In de huidige studie beschrijven we het microCT Imaging protocol stap voor stap, van monster fixatie tot gegevensanalyse, met behulp van drie ongewervelde mariene soorten. Specimens van de zeeanemonen Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) werden verzameld in de buurt van het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio. Ze hadden een sferische, zachte Body die ongeveer 2 cm in diameter was (Figuur 1a-C). Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) monsters werden ook verzameld in de buurt van Misaki Marine Biological station. Het waren slanke wormen die ongeveer 1,5 cm lang waren, met stoere chaetae aanwezig langs het hele lichaam (figuur 1d). Een Xenoturbella japonica³⁵ (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) specimen werd verzameld in de buurt van Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, tijdens het 13e JAMBIO Coastal organisme joint Survey. Het was een zacht-bodied worm die ongeveer 0,8 cm lang was (Figuur 1e). Aanpassingen voor de voorwaarden en configuraties van elk monster worden gedetailleerd toegelicht. Onze studie biedt verschillende suggesties voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op mariene ongewervelde dieren, en we hopen dat het biologen zal inspireren om dit protocol voor hun onderzoek te gebruiken.