Levantando o Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análise dos fenótipos Post-larval e imuno-histoquímica toda a montagem
Summary
Neste protocolo, demonstramos como Astyanax mexicanus adultos se reproduzem, levantar as larvas e executar toda a montagem imuno-histoquímica na pós larval peixe para comparar os fenótipos de superfície e caverna morfotipos.
Abstract
Rio e caverna-adaptado de populações de Astyanax mexicanus mostram diferenças em morfologia, fisiologia e comportamento. Pesquisa focada em comparar formas adultas revelou a base genética de algumas destas diferenças. Menos é sabido sobre como as populações diferem em fases pós larvas (no início da alimentação). Tais estudos podem fornecer a introspecção como cavefish sobreviver a idade adulta em seu ambiente natural. Métodos para comparar o desenvolvimento pós-larva em laboratório necessitam de aquicultura padronizada e regimes de alimentação. Aqui descrevemos como criar peixes em uma dieta de rotíferos nutriente-ricos em não-recirculação de água para até fertilização post de duas semanas. Demonstramos como coletar peixes pós-larvas deste sistema de berçário e executar toda a montagem immunostaining. Immunostaining é uma alternativa atraente para a análise da expressão do transgene para investigar o desenvolvimento e função do gene na . mexicanus. O método de viveiro também pode ser usado como um protocolo padrão para estabelecer populações densidade-combinados para crescimento em adultos.
Introduction
O tetra mexicano, Astyanax mexicanus, é uma única espécie de peixe que existe como populações naturais do Rio (peixe de superfície) e um número de populações de caverna-moradia (cavefish) chamado para as cavernas que habitam (i.e., Tinaja, Molino, Pachón). Um número crescente de pesquisadores está usando a. mexicanus para investigar as bases genéticas e do desenvolvimento comportamental1,2,3,4, metabólica5,6 ,7,8e evolução morfológica9,10,11. Recursos disponíveis para estudos da . mexicanus incluem um genoma sequenciado e anotado12; transcriptoma13; tabela do desenvolvimento preparo14; e métodos para criação de16,de15,17, criando transgenics18e edição de genes19. Disseminação de ferramentas adicionais e atualizados protocolos padrão irá acelerar o crescimento da comunidade de pesquisa cavefish (ver estes métodos coleção20).
Nosso objetivo é adicionar ao repertório existente de ferramentas, fornecendo um método robusto para avaliar o gene atividade em situ no pós larval a. mexicanus, de uma forma comparável entre laboratórios. Existem dois desafios para alcançar este objetivo. Em primeiro lugar, há uma necessidade de regimes padronizados para incubação e levantando o peixe entre laboratórios, como diferenças em parâmetros tais como a alimentação e a densidade afeta crescimento e maturação, assim, afetar a atividade do gene. Em segundo lugar, há uma necessidade de um método padronizado ainda adaptável pela análise de padrões de atividade do gene no peixe pós larval. Podemos solucionar esses problemas aqui, estabelecendo práticas padrão para criar peixes para estágios pós-larvas e apresentando um robusto conjunto de montagem imuno-histoquímica (IHC) protocolo para avaliar a expressão gênica na . mexicanus.
Primeiramente, demonstramos como criar o peixe através de desova natural e identificar ovos fertilizados. Próximo descrito é como chocar ovos fertilizados (larvas) e transferi-los para recipientes de berçário, onde eles são mantidos em uma densidade de 20 peixes por contêiner por duas semanas sem recirculação ou trocando a água. Na fertilização post de 5 dias, os peixes desenvolveram para pós larvas estágios (já não ter um fornecimento de gema) e são fornecidos alimentados com algas Brachionus plicatilis (rotíferos) como uma fonte de alimento rico em nutrientes que não exigem a reposição diária. Este método fornece parâmetros de crescimento consistente para o desenvolvimento larval e pós larval.
Para avaliar a função dos genes, demonstramos como remover os peixes de recipientes de berçário e executar toda a montagem IHC. O método IHC apresentado é adaptado de protocolos desenvolvidos para uso com Danio rerio21 e é eficaz para examinar antígenos em todos os tecidos a. mexicanus testados, incluindo o cérebro, intestino e pâncreas. IHC é uma alternativa mais rápida para a geração de animais transgénicos para análise de expressão gênica e a localização da proteína. O presente protocolo será útil para estudos que visam crescer a. mexicanus e comparando os fenótipos de peixe de superfície e cavefish em fases pós larvas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparando a atividade do gene entre a superfície e a caverna a. mexicanus requer parâmetros ambientais cuidadosamente controlados e métodos que podem ser replicados através de laboratórios. Nosso protocolo para disparar a. mexicanus fornece consistente conteúdo nutricional durante o desenvolvimento pós larval. Após este regime alimentar, função do gene pode ser comparada com confiança entre populações usando o protocolo de imuno-histoquímica robusto que apresentamos. Aqui vamos discutir a importância desse método, bem como suas limitações e aplicações futuras.
Para atingir a densidade correspondente crescimento, encontramos que peixe pós larval pode ser levantada sem recirculação de água para duas semanas em recipientes de 1,5 L, em uma dieta de rotíferos. Este protocolo também pode ser usado para criar peixes em um sistema de recirculação; no entanto, rotíferos devem ser adicionados diariamente para compensar aqueles perdidos na saída do tanque. Náuplios de Artemia recém eclodidos são comumente usados como fonte de alimento na aquicultura, mas achamos que usar rotíferos tem vantagens consideráveis, incluindo: reduzido preço, biossegurança melhorada, nutrição consistente e melhor qualidade da água (veja abaixo).
Em primeiro lugar, o custo semanal em consumíveis é 4 dólares por rotíferos, comparados a 14 dólares para Artemia. Sobre Biossegurança, rotíferos são gerados em laboratório sob condições controladas, enquanto Artemia são coletados na natureza e sujeitos a variação natural em microbiana ou patógeno Sumário23. Além disso, a composição de nutrientes de náuplios de Artemia são ambientalmente determinado e, portanto, inconsistente. Náuplios prosperam em suas próprias lojas da energia após a eclosão; Eles rapidamente perdem o valor nutritivo como eles desenvolvem e idealmente devem ser alimentados com os peixes dentro de algumas horas. Artemia começam a alimentar-se na casa 12 pós-incubação, representando a primeira vez que eles poderiam ser nutricionalmente enriquecidos; no entanto, nesta fase eles tornaram-se demasiado grandes para 5 peixes dpf consumir. Em comparação, rotíferos continuamente se alimentam de microalgas marinhas, resultando em alto índice nutriente independentemente quando os rotíferos são colhidos. Rotíferos são muito menores do que os náuplios de Artmeia (160 x 400 mícrons), tornando-os mais fácil para o peixe capturar e engolir. Cavefish e peixes de superfície pós-larvas consomem rotíferos em quantidades semelhantes, sugerindo que não há diferença na preferência ou capacidade de capturar os rotíferos10.
Finalmente, náuplios de Artemia começam a morrer, em água doce, várias horas depois de ser apresentado. Restos de náuplios irão decair, diminuindo rapidamente a qualidade da água, se eles não são removidos manualmente. Remover o morto Artemia é demorado e perigoso para peixes pós larvas que não são muito maiores que as da artemísia e podem ser acidentalmente removido ou feridos. Rotíferos podem viver indefinidamente no contentor de berçário e prestação de alimentos aos peixes em todos os momentos sem afetar significativamente a qualidade da água.
Enquanto usar rotíferos como fonte de alimento tem benefícios consideráveis, para manter as algas de estoque, Rotifera deve ser adicionado ao sistema de cultura diariamente. Isto pode ser conseguido com um alimentador automático que dispensa algas líquidas dentro do recipiente de cultura Rotifera (ver Tabela de materiais). Rotíferos devem também ser colhidos este set-up a cada 24-48 horas para manter a saúde da cultura. Pesquisadores que criam peixe muito raramente (uma vez por ano, por exemplo) e não estão preocupados em fazer comparações entre as populações no pós larvas estágios podem preferir Artemia como fonte de alimento, uma vez que os embriões encysted podem ser aquecidos a qualquer momento.
Recomendamos que o número de larvas hachuradas e sobreviventes para monitorar o sucesso da incubação e crescimento de rastreamento. Se a maioria dos embriões ou larvas morrer, pode ser devido à contaminação bacteriana ou fúngica. Recomenda-se monitorar a qualidade da água da água a peixe pronto e esterilizar todos os equipamentos com etanol a 70%. Recipientes de berçário podem ser usados novamente depois que eles são limpos e esterilizados. Para minimizar o risco de doença, é também fundamental para remover qualquer peixe morto de recipientes de berçário e não adicionar rotíferos antes dpf 5, quando os peixes começam a comer.
A. mexicanus são sexualmente maduros em cerca de um ano de idade. Esta é uma limitação para a geração de transgénicos a. mexicanus comparado com Danio rerio (zebrafish) que são capazes de se reproduzir em 10-12 semanas24. Imuno-histoquímica (IHC) é um método alternativo para investigar a expressão dos genes e a localização da proteína. O protocolo descrito aqui pode ser adaptado a cada passo e usado para detectar antígenos em qualquer tecido de interesse. É importante observar, no entanto, que alguns tecidos podem ser mais difíceis de Visualizar em peixes de superfície devido à pigmentação (uma barreira que não existe em unpigmented cavefish), que podem influenciar a interpretação de estudos comparativos. Para resolver esse problema potencial, superfície peixe pigmento pode ser branqueado após fixação usando 3% de peróxido de hidrogênio.
IHC requer fixação de tecidos bem sucedidos, bloqueio e penetração de anticorpo. Métodos para cada variam dependendo do tecido e da proteína de interesse. O fixador e fixação de tempo deve preservar a arquitetura cell, mantendo o epítopo do antígeno. Para este protocolo, podemos usar um fixador do cross-linking (paraformaldeído) e omitir um fixador de desnaturação (como metanol ou acetona). Nós achamos que a incubação em acetona diminuída sinal de anticorpo para marcadores neuronais e do pâncreas. A etapa de bloqueio é essencial para evitar anticorpos de ligação às proteínas não-alvo no tecido. Este método usa uma combinação de soro normal (5%) e BSA (0,2%) na solução de bloqueio. A solução de bloqueio contém anticorpos e proteínas que se ligam aos locais reativos em proteínas no tecido, diminuindo a ligação não-específica dos anticorpos primários e secundários.
Para atingir a penetração do anticorpo, o tecido deve ser permeabilizado. Isto pode ser conseguido com detergentes ou solventes de desnaturação, mas deve ser otimizado para preservar o epítopo do antígeno. Nosso protocolo usa uma combinação de Triton e dimetil sulfóxido (DMSO). Triton e DMSO são incluídos durante as etapas de incubação bloqueando e anticorpos em concentrações de 0,5% e 1%, respectivamente. Usando esta concentração, temos observado a coloração no cérebro, pâncreas, intestino e músculo, sugerindo que é provável eficaz para penetração em todos os tecidos. Tamanho dos peixes também pode influenciar a penetração. Este protocolo não foi testado em peixes maiores que 14 dias de idade (aproximadamente 7 mm de comprimento). Para solucionar problemas de mancha, é aconselhável alterar as etapas de penetração de fixação, bloqueio e anticorpo. Também é importante examinar a conservação da sequência do antígeno com a proteína a. mexicanus de interesse usando o genoma disponíveis25.
A. mexicanus é um excelente modelo para investigar a evolução como populações da mesma espécie que evoluíram em ambientes drasticamente diferentes podem ser comparadas diretamente no laboratório. Protocolos padrão de criação, tanto dentro como entre laboratórios, são essenciais para a compreensão das diferenças biológicas entre os peixes de superfície e cavefish. Nosso artigo fornece um método para examinar o desenvolvimento e a atividade do gene em pós larvas peixes expostos aos parâmetros de crescimento consistente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
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